易智華，周聰發(fā)，雷瓊瓊，胡夏菊，李玲艷，梁尚棟

(南昌大學(xué) 1. 護(hù)理學(xué)院、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染并發(fā)外周神經(jīng)病理損傷時，表現(xiàn)為肢體遠(yuǎn)端感覺神經(jīng)病變[1-2]，主要癥狀為周圍神經(jīng)病理性疼痛，影響約60% HIV感染患者，隨著病程延長，極度疼痛頻現(xiàn)，嚴(yán)重者可喪失行走功能[3]。其發(fā)病率高、機(jī)制復(fù)雜、治療困難，常規(guī)鎮(zhèn)痛藥副作用大[4]。因此，尋求安全高效藥物，闡明其作用靶點(diǎn)，減輕HIV感染患者神經(jīng)病理痛迫在眉睫。

HIV感染導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變時，背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)神經(jīng)元和傳入神經(jīng)纖維均受損。DRG可將外周神經(jīng)末梢感受的傷害性刺激信號傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]。HIV病毒包膜糖蛋白gp120可誘發(fā)周圍神經(jīng)的機(jī)械痛敏和熱痛敏，研究表明，嘌呤2X受體可輔助gp120進(jìn)入巨噬細(xì)胞，gp120與巨噬細(xì)胞的相互作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)病理痛的發(fā)生[5]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)[6]，表達(dá)在DRG神經(jīng)元的嘌呤2X3受體(P2X3R)通過激活ERK信號通路，介導(dǎo)HIV gp120誘發(fā)的周圍神經(jīng)病理痛，應(yīng)用P2X3R拮抗劑可明顯減輕模型大鼠痛行為。中藥單體蛇床子素(osthole，Ost)是傳統(tǒng)中藥蛇床子的主要有效成分之一，具有抗炎、抗病原微生物、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[7-8]。本研究通過建立gp120浸浴坐骨神經(jīng)大鼠模型，觀察Ost處理后，模型大鼠痛行為及大鼠DRG中P2X3R表達(dá)變化及作用機(jī)制，為治療HIV gp120誘發(fā)周圍神經(jīng)病理痛，尋求毒副作用小、適合長期用藥的天然藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 健康成年SD大鼠，♂，體質(zhì)量(210±20)g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，動物使用許可證號：SYXK(贛)2015-0001。HEK293細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 Ost(美國Selleck Chemicals公司)；ATP、gp120(美國Sigma Aldrich)；P2X3R引物(上海生工生物)；抗β-actin抗體、P2X3R抗體(以色列Alomone Lab)；ERK、p-ERK抗體(美國CST)；腫瘤壞死因子α受體(tumor necrosis factor α receptor, TNF-αR)抗體(美國Abcam)；人pcDNA3.0-EGFP-P2X3R質(zhì)粒由上海諾百生物公司構(gòu)建，EGFP與P2X3R融合。

1.1.3儀器 BME-403 Von Frey機(jī)械刺激儀、BME-410C型熱痛刺激儀(中科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；全細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)(美國Axon200B)；7500型qPCR儀(ABI公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 方法

1.2.1神經(jīng)病理痛大鼠模型的構(gòu)建 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分4組(每組8只)：假手術(shù)組(sham)、假手術(shù)加Ost處理組(sham+Ost)、gp120坐骨神經(jīng)浸浴處理模型組(gp120)、gp120模型并給予Ost作用組(gp120+Ost)。gp120神經(jīng)病理痛大鼠建模：100 g·L-1水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1，腹腔注射)大鼠，無菌條件下，取大鼠左大腿后外側(cè)切口，鈍性分離坐骨神經(jīng)，用250 μL HIV gp120(用含大鼠血清白蛋白濃度為1 mL·L-1的生理鹽水溶解200 ng gp120)浸透的外科可吸收性無菌明膠海綿(祥恩，2 mm× 6 mm)，疏松包裹在坐骨神經(jīng)的三支分叉近端，縫合肌肉與皮膚。Sham組大鼠所用明膠海綿浸泡液不含gp120，其余同模型組。Sham+Ost組及gp120+Ost組大鼠于術(shù)前7 d及整個建模期灌胃給予Ost (40 mg·kg-1·d-1)。術(shù)后d 14將4組大鼠迅速斷頭，取左側(cè)L4～L6 DRG備用。

1.2.2大鼠痛行為檢測 建模術(shù)前(0 d)及術(shù)后d 1、3、5、7、9、11、14測定各組大鼠機(jī)械痛縮足反射閾值(paw withdrawal threshold, PWT)與熱痛縮足反射潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)。每次測量的時間和其它條件均保持一致。

1.2.2.1PWT檢測 BME-404電子機(jī)械刺激儀，測試針尖端接觸面直徑0.6 mm，測痛范圍0～50 g，分辨率0.05 g。大鼠置于鐵絲網(wǎng)架上的透明有機(jī)玻璃盒中(20 cm×10 cm×30 cm)適應(yīng)0.5 h，用測試針刺激大鼠左足底，從小力度開始，直到某個力度刺激大鼠引起縮足反應(yīng)，電腦軟件自動記錄此次壓力值，為有效閾值，相鄰兩次測量的間隔時間至少為3 min，刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩腿等)完全消失后才進(jìn)行下次測量。一共記錄3次，3次的平均值即為PWT。

1.2.2.2PWL檢測 采用BME-410C型全自動熱痛刺激儀。將與上述相同的玻璃盒與大鼠放在3 mm厚的玻璃板上，熱輻射燈照射大鼠左足底，記錄從照射到出現(xiàn)抬腿的時間，一共測量3次，取3次均值作為PWL。每次切斷時間為30 s，且間隔3 min以上，以防組織損傷。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR (qPCR) 檢測 提取大鼠DRG總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。P2X3R上游引物：5′-CCAACAGAGTCATGGACAGT-3′，下游引物：5′-GGACAGAATCCTTGCATTTGA-3′；β-actin上游引物：5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。用2-ΔΔCT法計(jì)算P2X3受體mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4蛋白印跡檢測 將DRG置于加有200 μL組織裂解液(含PMSF)的1 mL勻漿器中，冰上反復(fù)研磨裂解后，置1.5 mL EP管，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清，加入6×loading buffer和DTT，混勻后煮沸5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?0%的SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，一抗4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，二抗孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測 PBS清洗DRG，4%多聚甲醛固定48 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚5 μm)，37 ℃烘干2 h后，室溫保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時，切片60 ℃烘烤30 min脫蠟，Triton X-100作用15 min， H2O2作用5 min，5%山羊血清封閉1 h，P2X3R一抗4 ℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育30 min，DAB顯色2 min，PBS終止顯色反應(yīng)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下拍片。Image-Pro Plus軟件分析每組(n=8)切片中神經(jīng)元染色光密度值，每張切片選取一個有代表性的視野，統(tǒng)計(jì)各組切片中P2X3受體陽性反應(yīng)差異。

1.2.6HEK293細(xì)胞培養(yǎng)與P2X3受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 常規(guī)復(fù)蘇HEK293細(xì)胞，在37 ℃含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代，均勻接種在35 mm培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞密度為1×105個/cm2，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合度，瞬時轉(zhuǎn)染人pcDNA3.0-EGFP-P2X3R質(zhì)粒(Lipofectamine 2000，Invitrogen)，孵育6 h。以O(shè)pti-MEM洗滌細(xì)胞，并孵育24～48 h。倒置熒光顯微鏡下觀察各皿細(xì)胞GFP熒光顯色情況，每皿細(xì)胞尋找3個具有代表性的視野，觀察100個細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。轉(zhuǎn)染后1～2 d進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。

1.2.7全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn) 熒光倒置顯微鏡下實(shí)施全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄全細(xì)胞電流。兩步法拉制微電極，電極液充灌微電極，微電極填充液由(以mmol·L-1計(jì))K葡萄糖酸鹽145、EGTA 0.75、HEPES 10、CaCl20.1、MgATP 2、Na3GTP 0.3組成的內(nèi)部溶液。用含有(以mmol·L-1計(jì))NaCl 126、KCl 2.5、葡萄糖10、MgCl21.2、CaCl22.4、NaHCO318的細(xì)胞外溶液連續(xù)灌注。操縱微電極尖端接近細(xì)胞表面，微電極內(nèi)施加負(fù)壓，形成高阻封接(1～10 GΩ)，鉗制電壓于-60 mV，吸破細(xì)胞膜。藥物濃度為ATP 100 μmol·L-1、Ost 100 μmol·L-1，藥物灌流管直徑0.2 mm，管口距記錄細(xì)胞約100 μm。給藥時間2 s，洗脫時間4 min。數(shù)據(jù)以2 Hz低通濾波，以5 kHz數(shù)字化，并使用Axopatch 200B膜片鉗放大器、Digidata 1440A 接口和pClamp10.3軟件(Axon儀器)存儲在實(shí)驗(yàn)室計(jì)算機(jī)中。SigmaPlot軟件繪制細(xì)胞電流變化圖。

2 結(jié)果

2.1 Ost抑制gp120模型大鼠DRG中P2X3受體的表達(dá)上調(diào)如Fig 1所示，gp120模型組DRG中P2X3R mRNA及蛋白表達(dá)水平較sham組明顯增加(P<0.01)，gp120+Ost組P2X3R mRNA及蛋白表達(dá)水平較gp120模型組降低(P<0.01)；sham與sham+Ost組之間無差異(P>0.05)。

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsgp120 group

2.2 Ost改善gp120模型大鼠機(jī)械痛敏(PWT)與熱痛敏(PWL)如Fig 2所示，造模前各組間PWT及PWL的基礎(chǔ)值差異無顯著性(P>0.05)。術(shù)后d 3 開始，gp120模型大鼠PWT及PWL相比sham組日趨降低(P<0.05或P<0.01)；gp120+Ost組大鼠PWT及PWL較gp120模型組增加(P<0.05,P<0.01)。

Fig 2 Osthole relieved mechanical(A) and thermal hyperalgesia(B) in gp120 treated rats

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsgp120 treated group

2.3 Ost降低gp120模型大鼠DRG中P2X3受體上調(diào)的免疫反應(yīng)性免疫組織化學(xué)染色對各組大鼠L4～L6 DRG P2X3受體進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示，P2X3受體表達(dá)在神經(jīng)元上，且gp120組P2X3受體表達(dá)較sham組升高(P<0.01)，gp120+Ost組P2X3受體表達(dá)較gp120組降低(P<0.01)；sham組與sham+Ost組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 Ost降低gp120模型大鼠DRG中TNF-αR表達(dá)Fig 4的蛋白印跡結(jié)果顯示，gp120模型組大鼠DRG 中TNF-αR表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)；gp120+Ost組TNF-αR表達(dá)水平較gp120模型組降低(P<0.01)；sham組與sham+Ost組TNF-αR表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 Effects of osthole on expression of P2X3receptor immunoreactivity in L4～L6 DRGs

Arrows indicate P2X3receptor positive neurons.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsgp120 treated group.

Fig 4 Osthole decreased expression of TNF-αR protein in DRG of gp120 treated rats n=6)

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsgp120 group

2.5 Ost下調(diào)gp120模型大鼠DRG中ERK的磷酸化水平如Fig 5所示，各組大鼠DRG中ERK1/2的蛋白表達(dá)水平無明顯差異；p-ERK1/2的表達(dá)水平，gp120模型組較sham組明顯增加(P<0.01)，gp120+Ost組較gp120模型組降低(P<0.01)；sham與sham+Ost組無差異。

Fig 5 Effects of osthole on expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in L4～L6 DRGs n=6)

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsgp120 group

2.6 Ost抑制HEK293細(xì)胞ATP激動電流Fig 6的全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)顯示，Ost降低轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-EGFP-P2X3R質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞ATP的激動電流。

3 討論

已有研究表明，周圍神經(jīng)應(yīng)用gp120后可產(chǎn)生機(jī)械痛覺過敏行為[9]，提示gp120可能是HIV感染引發(fā)神經(jīng)病理痛的重要因素[4]。本研究結(jié)果顯示，用gp120浸浴的海綿作用于坐骨神經(jīng)后，大鼠的機(jī)械痛敏、熱痛敏與假手術(shù)組比較逐漸增強(qiáng)。同時，gp120模型大鼠DRG蛋白印跡實(shí)驗(yàn)、免疫組織化學(xué)與qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P2X3受體蛋白與mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，說明P2X3受體上調(diào)與gp120誘發(fā)的痛行為有關(guān)。Ost處理后，gp120模型大鼠DRG中P2X3受體蛋白與mRNA表達(dá)均較未處理的gp120模型大鼠降低，且Ost處理后大鼠機(jī)械痛敏與熱痛敏減弱。研究結(jié)果提示，Ost可降低P2X3受體表達(dá)而影響大鼠機(jī)械痛敏與熱痛敏行為。

Fig 6 Effects of osthole on ATP-activated current in HEK293 cells transfected with hP2X3 receptor

ATP作為受損細(xì)胞和感覺神經(jīng)末梢釋放的遞質(zhì)[10]，可激活神經(jīng)元上的P2X3受體[11]，增加神經(jīng)元的異常興奮，導(dǎo)致神經(jīng)病理痛。HIV gp120可直接或間接刺激神經(jīng)系統(tǒng)釋放促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α等[4, 12-13]，它們可激活神經(jīng)元上的TNF-α受體，從而增加神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致炎性反應(yīng)加重。本研究結(jié)果顯示，gp120模型大鼠DRG中TNF-α受體表達(dá)較假手術(shù)組增加，說明gp120處理可誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，誘發(fā)模型大鼠出現(xiàn)神經(jīng)病理痛行為。gp120+Ost組大鼠DRG中TNF-α受體表達(dá)較gp120模型大鼠降低，提示Ost可能通過其抗炎作用，減輕gp120誘發(fā)的機(jī)械痛敏與熱痛敏。

ATP是神經(jīng)系統(tǒng)重要遞質(zhì)。HEK293細(xì)胞無功能性受體表達(dá)，常作為轉(zhuǎn)染相關(guān)受體進(jìn)行功能研究的工具。本研究發(fā)現(xiàn)，Ost可降低轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-EGFP-P2X3R質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞ATP激動電流，提示Ost通過阻斷P2X3受體的激活，抑制神經(jīng)元的異常放電，從而減輕機(jī)械痛敏和熱痛敏。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P2X3受體主要表達(dá)在DRG神經(jīng)元上，提示Ost可影響gp120對神經(jīng)元的病理性作用，從而影響gp120引發(fā)的P2X3受體激活。

ERK的磷酸化代表其信號通路的激活，參與初級傳入神經(jīng)受損引起的疼痛信號傳遞[14]。因此，阻斷初級感覺神經(jīng)元中ERK的活性可減輕機(jī)械痛敏和熱痛敏。研究表明，P2X3受體激活之后，ERK1/2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也被激活，進(jìn)而發(fā)生疼痛[14-15]。本研究結(jié)果中，HIV gp120模型大鼠DRG中 p-ERK1/2與ERK1/2蛋白條帶光密度比值較假手術(shù)組更高，說明DRG中ERK1/2的磷酸化與P2X3受體介導(dǎo)的gp120引發(fā)的神經(jīng)病理痛有關(guān)。Ost處理后，模型大鼠DRG中 p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達(dá)較gp120模型大鼠明顯降低，結(jié)果提示Ost下調(diào)P2X3受體表達(dá)，進(jìn)而抑制ERK1/2的磷酸化，使機(jī)械痛敏與熱痛敏減輕。

總之，HIV gp120作用于周圍神經(jīng)可導(dǎo)致DRG中P2X3受體表達(dá)升高，gp120處理增加促炎性因子的釋放，上調(diào)的P2X3受體及促炎因子作用可導(dǎo)致DRG神經(jīng)元敏化，造成gp120誘發(fā)的神經(jīng)病理痛。Ost通過降低gp120引起的DRG中P2X3受體表達(dá)上調(diào)，通過減少促炎因子TNF-α的釋放而減少TNF-αR的激活，抑制ERK1/2的磷酸化，阻斷疼痛信號傳遞通路，減輕gp120引起的機(jī)械痛敏與熱痛敏。

(致謝：本研究在江西省高等學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所及南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝支持！)