白祥建，朱美林，李博涵，李紅梅，霍 強，吳成柱

(蚌埠醫(yī)學院藥學院，安徽 蚌埠 233000)

非小細胞性肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌患者的80%，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期或中晚期，5年生存率不足10%，嚴重危害著人類健康和生命[1]。在過去較長時間內(nèi)，以小分子靶向藥物吉非替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，在NSCLC治療中發(fā)揮重要作用。然而，隨著化療的推進，EGFR-TKI在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的NSCLC類型中不能發(fā)揮出很好的療效，不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥，導致化療失敗[2]。因此，尋找更為低毒有效的化療藥物，成為當前NSCLC治療研究的熱點。

PI3K/Akt信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。Akt作為該信號通路的關鍵蛋白，能夠調(diào)節(jié)下游相關基因和分子，從而影響腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程。大量研究表明，PI3K/Akt信號通路在許多腫瘤組織中持續(xù)活化，嚴重影響化療的進行。因此，針對該信號通路的靶向抑制劑的研究已經(jīng)成為了關注焦點，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路。

從中草藥中獲得的天然產(chǎn)物，由于其結(jié)構(gòu)復雜多樣、毒性低，且具有多靶點、多途徑的抗腫瘤活性，已經(jīng)成為腫瘤藥物研發(fā)的重要來源之一[4]。小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTL)是從中草藥小白菊(Chrysanthemumparthenium)中提取分離到的一種倍半萜內(nèi)脂類化合物(結(jié)構(gòu)見Fig 1A)，可用于治療頭痛、風濕等疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，PTL具有很強的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡等[5]。而關于PTL對EGFR突變型的NSCLC細胞株H1975的作用卻未見報道。本研究以H1975細胞作為研究對象，觀察PTL對其增殖、凋亡、侵襲、遷移等的影響，并探討其相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 PTL，由蚌埠醫(yī)學院藥物化學實驗室提供，純度為99.5%。RPMI 1640，購自HyClone公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，購自美國Sigma公司；結(jié)晶紫染液為碧云天公司產(chǎn)品；Transwell小室和基質(zhì)膠(Matrigel)，購自BD公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒，購自貝博生物；β-actin、Bcl-2、Bax抗體，購自Proteintech公司；缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)抗體，購自Abcam公司；caspase-3、Akt、p-Akt(Ser473)抗體，購自CST公司。

1.1.2細胞株 EGFR突變型NSCLC細胞株H1975，購自上海細胞庫。培養(yǎng)于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.1.3儀器 細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；流式細胞儀(BD公司)；微量高速冷凍離心機(BECKMAN COULTER公司)；酶標儀(BioTek公司)；電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)移槽(Tanon公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 MTT法檢測PTL對細胞增殖的影響取處于對數(shù)生長期的H1975細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，更換含不同濃度PTL(6.25、12.5、25、50 μmol·L-1)的培養(yǎng)液，同時設陰性對照組和空白對照組，每組設3個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，加入10 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，酶標儀上振蕩20 s，以酶標儀檢測波長490 nm處吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%。以上實驗重復3次。

1.3 集落克隆形成實驗將H1975細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞。培養(yǎng)24 h后，更換含不同濃度PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)或等體積DMSO的新鮮培養(yǎng)液。置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，預冷PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，然后加入結(jié)晶紫染液染色15 min，再用雙蒸水洗去染液，室溫下晾干，拍照。實驗重復3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡取生長良好的H1975細胞，接種于6孔板中，每孔3×105個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。然后更換含PTL(濃度為7.5、15、30 μmol·L-1)或等體積DMSO的新鮮培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中作用24 h。作用結(jié)束后，收集細胞，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清，加入預冷的Annexin V結(jié)合液重懸細胞，置冰浴，每管分別加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL PI染液，避光染色20 min，上流式細胞儀檢測分析。實驗重復3次。

1.5 Transwell法檢測細胞遷移取處于對數(shù)生長期的H1975細胞，胰酶消化收集細胞，再用PBS重懸細胞，洗去含血清的細胞培養(yǎng)液，接著用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為2.5×108·L-1。小室上室為200 μL細胞懸液，即5×104個細胞，并加入不同濃度的PTL(0、1.25、2.5、5 μmol·L-1)，將小室放置12孔板中。下室為800 μL含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。作用結(jié)束后，小心吸去上室的細胞懸液，用4%多聚甲醛固定15 min，再用結(jié)晶紫染液染色15 min，然后將小室用PBS清洗2遍，棉棒小心擦去上室未遷移的細胞。倒置顯微鏡下隨機選取3個視野，拍照(×200)保存，統(tǒng)計穿過微孔膜的細胞。以上實驗重復3次。

1.6 Transwell法檢測細胞侵襲取基質(zhì)膠放于冰上融化，并用預冷的RPMI 1640培養(yǎng)基4 ∶1稀釋。每個小室中加入45 μL基質(zhì)膠，鋪勻，放置培養(yǎng)箱中1～2 h。同遷移實驗中處理細胞，調(diào)整細胞濃度為5×108·L-1，每個小室加入200 μL細胞懸液，即1×105個細胞。并加入不同濃度的PTL(終濃度0、1.25、2.5、5 μmol·L-1)，作用時間為48 h。其余步驟同“1.5”。以上實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測相關蛋白表達取處于對數(shù)生長期的H1975細胞，接種于6孔板中，每孔3×105個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h至貼壁。按實驗設計，更換含PTL(7.5、15、30 μmol·L-1)或等體積DMSO的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)作用24 h。作用結(jié)束后，收集細胞，2 500 r·min-1離心10 min，棄上清，每孔加入50 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，置冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，取上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量。每組取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，1×TBST洗3次，每次5 min， Bcl-2、Bax、caspase-3、Akt、p-Akt(Ser473)、HIF-1α、MMP-9一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，每次5 min，加入顯影液，凝膠成像儀獲取圖像。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 PTL對H1975細胞的增殖抑制作用MTT結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，PTL對H1975細胞的增殖抑制作用明顯增加，其中PTL處理H1975細胞24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(15.83±0.35)μmol·L-1、(14.04±0.11)μmol·L-1、(14.05±0.21)μmol·L-1(Fig 1B)。同時，根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取了低濃度的PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)處理H1975細胞，觀察到PTL能在低濃度明顯抑制H1975細胞集落的形成(P<0.05)，見Fig 1C、1D。以上結(jié)果表明，天然產(chǎn)物PTL對NSCLC細胞系H1975具有較強的抑制增殖作用，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

2.2 PTL對H1975細胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測PTL對H1975細胞凋亡的影響。Fig 2結(jié)果顯示，PTL(7.5、15、30 μmol·L-1)能明顯誘導H1975細胞凋亡，凋亡率分別為(26.91±4.11)%、(41.43±6.36)%、(84.60±3.51)%，隨著給藥濃度的增加，凋亡比例逐漸升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 PTL對凋亡相關蛋白表達的影響不同濃度的PTL處理H1975細胞24 h后，采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達的變化。Fig 3結(jié)果顯示，PTL可促進H1975細胞中促凋亡蛋白Bax表達，而減少抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而使Bax/Bcl-2的比例明顯升高。caspase家族蛋白為凋亡的執(zhí)行者，PTL能明顯使caspase-3蛋白發(fā)生裂解，從而誘導細胞發(fā)生凋亡。

Fig 1 Effects of PTL on proliferation of H1975 cells n=3)

A: The structure of PTL; B: Cytotoxic effect of PTL on H1975 cells for 24 h, 48 h, 72 h by MTT assay; C: Cell colonies significantly decreased with the increase of PTL concentration; D: Data analysis of C.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 2 Effect of PTL on apoptosis of H1975 cells n=3)

A: PTL induced apoptosis in H1975 cells by flow cytometry; B: With the increase of PTL concentration, cell apoptosis rate gradually increased.**P<0.01vscontrol.

2.4 PTL對H1975細胞Akt、p-Akt蛋白表達的影響Akt作為腫瘤細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路的關鍵蛋白，對腫瘤的生長、發(fā)展具有重要作用。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，PTL能明顯降低H1975細胞內(nèi)Akt蛋白及p-Akt(Ser473)的表達(P<0.01)，從而抑制其信號通路的傳導。

2.5 PTL對H1975細胞侵襲和遷移的影響采用Transwell小室法檢測PTL對H1975細胞侵襲和遷移能力的影響，通過統(tǒng)計穿透到小室下方的相對細胞數(shù)目，可以反映出細胞侵襲和遷移能力的改變。Fig 5結(jié)果表明，PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)能明顯抑制H1975細胞向下侵襲浸潤生長，其48 h抑制率分別為(57.62±7.40)%、(71.77±5.54)%、(82.26±1.50)%，相比于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。遷移實驗結(jié)果表明，PTL能有效降低H1975細胞遷移能力，PTL(1.25、2.5、5 μmol·L-1)作用H1975細胞24 h后，抑制率分別為(47.87±2.33)%、(57.65±6.84)%、(74.28±4.02)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Fig 3 Effects of PTL on expression level of Bcl-2, Bax, caspase-3 in H1975 cells by Western blot n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4 Effects of PTL on expression levels of Akt, p-Akt (Ser473) in H1975 cells by Western blot n=3)

**P<0.01vscontrol

Fig 5 Effects of PTL on invasion and migration of H1975 cells by Transwell assay (×200)

2.6 PTL對H1975細胞HIF-1α和MMP-9蛋白表達的影響Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，PTL能明顯降低H1975細胞中MMP-9及HIF-1α的表達(P<0.05)。

Fig 6 Effects of PTL on expression levels of HIF-1α, MMP-9 in H1975 cells by Western blot n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

EGFR的激活與異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用。在過去較長的一段時間內(nèi)，針對EGFR為特定靶點的小分子抑制劑成為了晚期NSCLC患者的首選。EGFR-TKI能特異性地抑制EGFR及其下游的信號通路，如PI3K/Akt，從而抑制腫瘤細胞生長增殖，誘導凋亡。但隨著治療的推進，患者大多會出現(xiàn)EGFR突變，繼而產(chǎn)生耐藥。其中，EGFR的20號外顯子790位甲硫氨酸置換蘇氨酸密碼子的突變，即T790M突變，約占EGFR突變類型的50%～60%，是腫瘤對EGFR-TKI產(chǎn)生獲得性耐藥的重要原因[6]。本研究中，H1975細胞是T790M突變型NSCLC細胞株，因此，我們以其為研究對象，希望為NSCLC的治療提供一定的研究基礎。

我國中草藥資源豐富，且?guī)浊陙硇纬闪送暾闹嗅t(yī)理論，來指導中藥的臨床使用。對于腫瘤的治療，中藥有其獨特的作用。中藥中富含多種化學成分，已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)中發(fā)現(xiàn)先導化合物的重要來源。其中，以和厚樸酚、姜黃素、雷公藤甲素等為代表的天然產(chǎn)物，具有良好的抗腫瘤活性，包括抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥等[7-9]，都已成為極具潛力的抗腫瘤新藥。事實上，目前已上市的抗腫瘤藥物大多也都來自天然產(chǎn)物，包括紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等。PTL作為一種天然產(chǎn)物，對多種腫瘤細胞具有很好的殺傷作用，但對于耐藥NSCLC的研究未見報道，仍有較好的潛力，值得挖掘。

誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡是目前抗腫瘤藥物研發(fā)的靶點之一。凋亡是細胞程序性死亡，在維持細胞增殖與死亡的平衡中發(fā)揮重要作用，Bcl-2家族蛋白具有調(diào)控細胞凋亡的功能，Bax/Bcl-2比值變化能夠反映出細胞存活和凋亡的平衡關系。細胞發(fā)生凋亡也需要一些酶的作用，其中caspase扮演著重要角色，一直成為人們的研究熱點，而caspase-3的激活更是被認為是細胞發(fā)生凋亡的早期標志[10]。本研究中，PTL能明顯上調(diào)H1975細胞中促凋亡蛋白Bax水平，同時下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2水平，Bax/Bcl-2比例明顯升高，使caspase-3蛋白被激活，發(fā)生裂解，從而誘導H1975細胞發(fā)生凋亡。

Akt是腫瘤細胞重要信號通路PI3K/Akt中的關鍵分子，是整個PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導的核心。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，多種生長因子、信號蛋白等，均可通過磷酸化Thr308和Ser473位點激活Akt，磷酸化的Akt通過調(diào)節(jié)下游相關分子，對腫瘤細胞的增殖、凋亡等過程具有重要作用。研究表明，活化的Akt可以磷酸化Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bad，引起B(yǎng)ad與其伴侶蛋白(chaperone 14-3-3)結(jié)合，阻斷Bad蛋白的促凋亡功能，并激活下游分子Bcl-2釋放，從而抑制腫瘤細胞凋亡，也可直接磷酸化Bax蛋白，阻斷其促凋亡作用[11]。另外，caspase級聯(lián)反應是凋亡發(fā)生的主要原因，其中，caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，具有不可替代的作用，同樣，Akt可磷酸化下游caspase-3、caspase-9等家族蛋白，使其失活，抑制其促凋亡作用[12]。本研究Western blot結(jié)果表明，PTL能明顯降低H1975細胞內(nèi)Akt、p-Akt(Ser473)蛋白水平，有效抑制Akt蛋白的活化，從而抑制其下游信號通路的轉(zhuǎn)導，發(fā)揮促凋亡作用。

同時，大量研究表明，PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中也有著重要的作用。通過PI3K/Akt信號通路激活Akt，活化的Akt可通過下游的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，直接激活下游的HIF-1α，啟動血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因的轉(zhuǎn)錄，促進VEGF蛋白生成，增加腫瘤組織血供，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[13]。此外，活化的Akt能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，特別是上調(diào)MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平，參與細胞外基質(zhì)的降解，促進腫瘤細胞侵襲和遷移[14]。本研究Transwell實驗結(jié)果顯示，PTL能明顯抑制H1975細胞侵襲和遷移，同時Western blot實驗結(jié)果表明，PTL能明顯下調(diào)H1975細胞HIF-1α和MMP-9的表達，從而抑制H1975細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。

綜上所述，天然產(chǎn)物PTL能明顯誘導NSCLC細胞株H1975發(fā)生凋亡，同時抑制其侵襲和遷移，機制可能與PI3K/Akt信號通路中關鍵分子Akt被抑制有關，從而調(diào)節(jié)下游靶蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、HIF-1α及MMP-9的表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為天然產(chǎn)物PTL的臨床使用提供了一定的實驗基礎，但是作為有潛力的抗腫瘤新藥，其體內(nèi)的抗腫瘤作用及相應的毒副作用仍需要進一步研究。