袁為遠(yuǎn)，包凱帆，賈志榮，王曉鈺，鄭 劼，洪 敏，江國(guó)榮

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，科技部國(guó)家規(guī)范化中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2．南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院藥理系，江蘇 南京 210023；3．南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215003)

過(guò)敏性反應(yīng)是機(jī)體受到過(guò)敏原，如花粉、屋塵螨(house dust mite, HDM)等誘導(dǎo)后，引起的病理性組織損傷或者功能紊亂的一種免疫反應(yīng)。過(guò)敏性疾病主要包括過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性鼻炎等，其中患病率及復(fù)發(fā)率最高的為過(guò)敏性哮喘。據(jù)Global Burden of Disease Study資料顯示，全球約有2.4億過(guò)敏性哮喘患者，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3億，并且有研究顯示，該數(shù)值近年內(nèi)將持續(xù)上升[1]。過(guò)敏性哮喘是一種變應(yīng)原或其他因素引起的肺功能失常[2]，以適應(yīng)性的2型輔助性T細(xì)胞(type 2 T helper cell, Th2)功能異常為主要特征的2型免疫反應(yīng)。發(fā)病時(shí)，主要伴隨著Th2型細(xì)胞因子白介素(interleukin, IL)-4、IL-5、IL-13的產(chǎn)生，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils, EOS)增多、黏液分泌旺盛、氣道高反應(yīng)性，以及E型免疫球蛋白(immunoglobulin E, IgE)的表達(dá)增加。過(guò)敏性哮喘的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜[3]，目前尚未被完全了解，因此，進(jìn)一步研究過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制，并建立有效的干預(yù)或治療手段，對(duì)于降低其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率尤為重要。

20世紀(jì)末，美國(guó)學(xué)者Dixit等[4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)了鋅指蛋白A20，因其最初是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的，所以又被稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3, TNFAIP3)。隨著對(duì)于A20的深入研究，目前它被認(rèn)為是炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要是核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)的一種負(fù)調(diào)控因子，可以通過(guò)多種途徑抑制NF-κB的活化。目前已有若干報(bào)道證實(shí)，A20參與了過(guò)敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5-6]，其在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中的重要作用也越來(lái)越被重視。因此，對(duì)A20與過(guò)敏性哮喘的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，有利于為過(guò)敏性哮喘的預(yù)防和治療提供新思路。

1 A20的起源與結(jié)構(gòu)

鋅指蛋白A20，根據(jù)其cDNA克隆數(shù)而命名，是一種具有高度生物活性的胞質(zhì)蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，人類的A20基因序列定位于染色體中6q23.3位，其cDNA全長(zhǎng)為4 426 bp，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性作用的可讀區(qū)域框?yàn)? 370 bp(67～2 436 bp)。人的A20蛋白總共由790個(gè)氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為90 ku。進(jìn)一步對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)分析可知，A20屬于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBS)卵巢腫瘤(ovarian tumor, OTU)家族的一種，其N末端區(qū)(1～385)含有的半胱氨酸蛋白酶類OTU是A20蛋白的特征性結(jié)構(gòu)區(qū)域之一[7]。同時(shí)，A20蛋白也具有泛素化功能，A20蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)在其C末端(386～775)，該鋅指區(qū)域由7個(gè)Cys2-Cys2結(jié)構(gòu)組成[8]，其中第4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)具有E3泛素連接酶活性，可特異性地與底物結(jié)合，招募26S蛋白酶體，將靶蛋白降解。正是因?yàn)檫@兩種特殊的蛋白結(jié)構(gòu)(Fig 1)，A20蛋白具有了泛素化和去泛素化雙重功能，在炎癥調(diào)節(jié)中起著重要作用。

2 A20的生物學(xué)功能

A20是一種具有高度保守性的、胞質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)性蛋白，其在上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等中均有表達(dá)。已有研究表明，A20作為NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，在多種炎癥性反應(yīng)中扮演著重要的角色。A20蛋白可在多種促炎因子，如細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、TNF-α、IL-1等刺激細(xì)胞后大量表達(dá)，其中，A20基因3’端非翻譯區(qū)含有的4個(gè)“ATTTA”序列，是A20蛋白快速表達(dá)的基礎(chǔ)。盡管目前廣泛認(rèn)為A20是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的抗炎蛋白，但最初研究發(fā)現(xiàn)其是一種能夠保護(hù)由TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，A20可以通過(guò)不同途徑，抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化，除此之外，還可以抑制由CD40、IL-1，以及包括模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)等在內(nèi)誘導(dǎo)的NF-κB的活化，并且還可以抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體的激活[8]。A20在多種炎癥反應(yīng)中起著重要作用，特異性敲除小鼠體內(nèi)A20基因不久后，小鼠體內(nèi)多種器官即可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并且缺失A20蛋白的細(xì)胞無(wú)法阻斷由刺激因子誘導(dǎo)的NF-κB的活化。除此之外，近年來(lái)A20還被報(bào)道能調(diào)節(jié)其他細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Wnt通路、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)、自噬應(yīng)答等途徑。研究發(fā)現(xiàn)，A20還可以通過(guò)直接結(jié)合白細(xì)胞介素17受體A(interleukin-17 receptor type A, IL-17RA)的C末端結(jié)構(gòu)域，來(lái)抑制IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且A20可以抑制TNFR、IL-1R和NOD樣受體(NOD like receptors, NLR)信號(hào)通路，但是A20是否直接與這些受體結(jié)合，尚待考證。

Fig 1 Biochemical characteristics of A20 protein

TNF受體1(TNF receptor 1, TNFR1)能夠激活NF-κB活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，A20被認(rèn)為能通過(guò)調(diào)節(jié)該通路而成為炎癥性疾病的潛在治療靶點(diǎn)(Fig 2)。眾所周知，蛋白質(zhì)泛素化是生物體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)方式。該過(guò)程通過(guò)對(duì)靶蛋白進(jìn)行一系列的特異性修飾后，即可招募26S蛋白酶體，將靶蛋白降解，其中起蛋白質(zhì)降解標(biāo)簽作用的為K48多聚泛素蛋白鏈。除此之外，蛋白質(zhì)的泛素化也可以進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這主要依賴于K63多聚泛素蛋白鏈的作用，其可以被特異性的調(diào)控因子識(shí)別，啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)[9]。A20被普遍認(rèn)為是一種NF-κB信號(hào)的經(jīng)典負(fù)調(diào)控因子，且已有文獻(xiàn)證明，A20是一種泛素編輯酶復(fù)合體，同時(shí)具有E3泛素連接酶和DUB去泛素化酶活性。目前認(rèn)為，A20抑制NF-κB信號(hào)的機(jī)制一方面是因其蛋白N末端的OTU結(jié)構(gòu)域[7]，而受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacts with the protein kinase 1, RIP1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor- associated factor 6, TRAF6)和NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB- essential modulator, NEMO)等為OTU結(jié)構(gòu)域的結(jié)合底物[10-12]，并且RIP1、TRAF6、NEMO等被激活后，均能募集泛素蛋白聚合，形成K63多聚泛素化鏈。因此，A20能夠特異性地趨向K63鏈，破壞其多聚泛素化鏈完整性，從而阻斷相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。除了去泛素化活性之外，A20蛋白第4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域ZF4所具有的泛素連接酶功能，也參與NF-κB的抑制作用。A20的E3泛素連接酶活性能促進(jìn)RIP1募集以lys48位點(diǎn)連接為主的泛素蛋白的多聚化，也就是可以促進(jìn)靶蛋白附著K48多聚泛素化鏈，從而招募26S蛋白酶體降解RIP1，阻斷下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，A20可以通過(guò)去泛素化黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1)，負(fù)調(diào)控由T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)誘導(dǎo)的NF-κB的活化。在淋巴細(xì)胞中，TRAF6對(duì)MALT1的泛素化也是NF-κB活化所必需的[13]。A20的生物學(xué)功能依賴于其蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，隨著研究的發(fā)展，A20蛋白的更多功能也將會(huì)被發(fā)現(xiàn)。

Fig 2 A20 protein function in tumor necrosis factor receptor (TNFR)- induced NF-κB inhibition

3 A20與過(guò)敏性哮喘

過(guò)敏性哮喘是兒童和成人中最常見的慢性非傳染性疾病之一，其特征是以呼吸道癥狀多變、氣流受限為主。過(guò)敏性哮喘異質(zhì)性強(qiáng)，是由環(huán)境和基因相互作用的結(jié)果，發(fā)病后出現(xiàn)嚴(yán)重的氣道炎癥和氣道重塑[3]。目前，過(guò)敏性哮喘的治療目標(biāo)主要是實(shí)現(xiàn)對(duì)其良好的控制，盡量緩解過(guò)敏性哮喘癥狀，以及降低疾病復(fù)發(fā)幾率?？寡滓约爸夤軘U(kuò)張藥物的使用是治療過(guò)敏性哮喘的主要手段，盡管這些手段廣泛應(yīng)用于臨床，但仍難以緩解惡性哮喘的發(fā)病癥狀，也無(wú)法防止哮喘的復(fù)發(fā)。目前，全球有很多機(jī)構(gòu)都在研究過(guò)敏性哮喘，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。A20作為NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，能夠有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在過(guò)敏性哮喘中的研究也逐漸受到了重視。

目前，主要用于治療過(guò)敏性哮喘的為糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)類藥物，可以有效緩解氣道炎癥以及哮喘癥狀。GC既可以促進(jìn)抗炎因子分泌，又可抑制許多促炎因子的表達(dá)[14]。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與GC特異性結(jié)合后轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核，參與相關(guān)基因調(diào)控。GC的治療作用與A20的表達(dá)有關(guān)，Altonsy等[5]研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除A20后能明顯增加人支氣管上皮細(xì)胞分泌TNF-α，并且長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑(longacting β2-adrenoceptor agonists, LABAs)能通過(guò)增加A20的表達(dá)，負(fù)調(diào)控NF-κB的活化，進(jìn)而提高吸入性GC的抗炎作用。GC的抗炎作用還可通過(guò)與GR結(jié)合，促進(jìn)抗炎因子A20和NFBIA基因、蛋白的表達(dá)[15]。

A20功能紊亂能夠引起包括哮喘等多種免疫性疾病，但也有研究證明，A20可以限制過(guò)敏性氣道炎癥和耐受反應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，A20參與了低劑量LPS誘導(dǎo)的免疫耐受。持續(xù)給予小鼠低劑量LPS，能夠增強(qiáng)HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠的耐受性，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和肺組織勻漿中IL-4、IL-5、IL-13的表達(dá)明顯減少。而特異性敲除小鼠上皮細(xì)胞A20基因(Tnfaip3EC-KO)后，可明顯影響LPS誘導(dǎo)的免疫耐受、過(guò)敏性哮喘模型外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，以及BALF和肺組織勻漿中IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)均明顯增加[6]。Tan等[16]發(fā)現(xiàn)，滅活的銅綠假單胞菌藥劑能夠通過(guò)降低Act1，以及增加TLR4、A20的表達(dá)，來(lái)抑制卵清蛋白(ovalbumin, OVA)引起的過(guò)敏性氣道炎癥。此外，A20也參與了鋅對(duì)哮喘的調(diào)控機(jī)制。Morgan等[17]發(fā)現(xiàn)，短期鋅處理組并未改變A20和TRAF6水平，但是導(dǎo)致了RIP1(IKK上游一種重要的激活因子)的降解。為進(jìn)一步確定鋅作為哮喘治療劑的應(yīng)用效果，隨后建立過(guò)敏性氣道炎癥模型，給予鋅治療，結(jié)果表明鋅補(bǔ)充劑能夠通過(guò)調(diào)節(jié)A20活性而抑制NF-κB的表達(dá)，同時(shí)，補(bǔ)鋅后可以降低氣道高反應(yīng)性和血清中IgE水平，但對(duì)Th2型細(xì)胞因子表達(dá)無(wú)影響。因此，補(bǔ)充鋅可能是治療哮喘的一種潛在方法，并且主要是通過(guò)調(diào)控A20的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

過(guò)敏性哮喘的發(fā)生伴隨著大量Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL13的表達(dá)，在哮喘發(fā)病的初始階段，2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cell, ILC2)是經(jīng)典的，除了2型輔助性T細(xì)胞以外的Th2型細(xì)胞因子的主要來(lái)源之一。哮喘患者BALF和唾液中能夠檢測(cè)到大量ILC2的存在[18]，并且ILC2已被報(bào)道在炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)以及代謝平衡中十分重要，因此，ILC2與過(guò)敏性哮喘關(guān)系密切。與此同時(shí)，miRNAs作為調(diào)控基因表達(dá)的重要因子，在過(guò)敏性哮喘的研究中也逐漸受到重視[19]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a能夠通過(guò)抑制ILC2中A20和SOCS1蛋白、基因的表達(dá)，從而促進(jìn)IL-4、IL-5、IL-13的分泌[20]。在外源OVA誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠過(guò)敏性肺部炎癥模型中，當(dāng)體內(nèi)轉(zhuǎn)染入含有A20 cDNA(Ad-A20)的腺病毒后，能夠明顯減少氣道炎癥性細(xì)胞的募集，減輕氣道高反應(yīng)性及支氣管炎癥的發(fā)生，并且Ad-A20的保護(hù)性作用是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。HDM誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠肺勻漿中A20(通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號(hào)蛋白TRAF6的泛素化來(lái)抑制TLR反應(yīng))、IRAKM(結(jié)合MyD88和TRAF6，可以阻斷TLR作用，穩(wěn)定信號(hào)復(fù)合物)、Tollip(與IL-1R、TLR2和TLR4相互作用以防止細(xì)胞激活，并抑制IRAK自磷酸化)均有明顯增加[21]。且有報(bào)道表明，哮喘組中肺組織TGF-β1和CTCF mRNA水平與正常組相比明顯上升，而體內(nèi)給予外源性A20重組蛋白后明顯下降，提示外源性A20對(duì)于氣道上皮增生、平滑肌增殖的抑制作用與降低TGF-β1、CTCF的表達(dá)有關(guān)。

總之，目前A20均被視為一種抗炎蛋白，可以有效抑制各種炎癥信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。除了傳統(tǒng)的一些炎癥信號(hào)外，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)了A20的一些新的調(diào)控因素。NLRP3作為一種炎癥小體，參與了多種疾病的發(fā)生，哮喘患者體內(nèi)能夠檢測(cè)到NLRP3的高表達(dá)，并且HDM誘導(dǎo)的小鼠過(guò)敏性哮喘模型中能夠激活NLRP3炎癥小體的組裝。A20是TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活通路的有效抑制劑，A20的缺失能夠?qū)е翴L-1β的表達(dá)增加[22]，并且A20可以抑制NLRP3炎癥小體的激活[23]，說(shuō)明A20可以通過(guò)調(diào)控NLRP3的表達(dá)，緩解過(guò)敏性哮喘的炎癥狀態(tài)。此外，A20還可以調(diào)控一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。JAK-STAT是一種經(jīng)典的信號(hào)通路，膜受體活化后，能夠引起JAKs的磷酸化，隨后募集STATs，通過(guò)Src同源體2(Src homology 2, SH2)結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合，經(jīng)過(guò)JAKs信號(hào)傳遞引起STATs的磷酸化，進(jìn)一步形成STATs二聚體，進(jìn)入核內(nèi)與DNA啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄。JAK-STAT通路參與了Th2細(xì)胞的分化，并且IL-4、IL-13與其受體IL-4Rα、IL-13Rα結(jié)合后，也可激活JAK-STAT通路。De Wilde等[24]發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)特異性敲除A20基因后，IRF4、STAT1的表達(dá)明顯增加。Lee等[25]研究表明，小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)A20蛋白后，可以明顯改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥表現(xiàn)，并且過(guò)表達(dá)A20后，轉(zhuǎn)錄因子p-p65和p-STAT3的表達(dá)均明顯減少。因此，A20可通過(guò)多種途徑調(diào)控哮喘的發(fā)生。隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，A20更多的調(diào)控功能也將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，其可能成為治療過(guò)敏性哮喘的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

越來(lái)越多的結(jié)果顯示，A20在過(guò)敏性哮喘中扮演著重要的作用，參與了多種過(guò)敏性疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前普遍認(rèn)為A20主要是NF-κB的一種負(fù)調(diào)控因子，在參與過(guò)敏性哮喘發(fā)生的支氣管上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞(如Th2細(xì)胞、ILC2等)中的研究較為廣泛，但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。體內(nèi)特異性敲除A20后，能夠加重過(guò)敏性哮喘發(fā)病癥狀，給予重組A20能夠明顯緩解炎癥反應(yīng)，這些反應(yīng)主要是依賴于A20蛋白與RIP1、NEMO、TRAF6等特異性結(jié)合后，發(fā)揮泛素化和去泛素化雙重功能，起到信號(hào)抑制作用。除此之外，也有最新研究發(fā)現(xiàn)，A20可以調(diào)控IRF4、STAT3、STAT6等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，以及NLRP3炎癥小體的組裝，但是具體方式仍不清楚，提示A20可能存在多種負(fù)調(diào)控機(jī)制，并且其可能是治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。過(guò)敏性哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其多復(fù)發(fā)性成為世界性的難題，因此，對(duì)A20進(jìn)行基因解析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及調(diào)控機(jī)制探討，對(duì)于過(guò)敏性哮喘的預(yù)防和治療具有重大意義。