王雷 王明吉 黃磊 代璐璐 李顏君 鄭玉軍

[摘要]目的 研究ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族G成員2（ABCG2）在非小細胞肺癌吉非替尼耐藥中的作用，對吉非替尼耐藥的非小細胞肺癌治療提供依據(jù)。方法 培養(yǎng)人肺腺癌吉非替尼敏感細胞株A549及吉非替尼耐藥的人肺腺癌細胞系A(chǔ)549/GR，A549/GR細胞的耐藥性檢測應用MTT法。用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測被吉非替尼作用的A549/GR細胞及A549細胞中的ABCG2、p-AKT蛋白的表達情況。分別加入磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）通路激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及抑制劑LY294002，分析作用于上述兩種細胞的p-AKT、ABCG2蛋白表達情況。應用流式細胞儀測定A549及A549/GR細胞株中的ABCG2外排情況。收集2015年4月～2017年4月我院收治的非小細胞肺癌患者及健康人血清，分為非小細胞肺癌非耐藥組（20例）、非小細胞肺癌吉非替尼耐藥組（20例）和健康者組（20例）。應用ELISA法檢測三組的ABCG2表達。結(jié)果 隨著劑量的增加，吉非替尼對A549細胞及A549/GR細胞的抑制作用均增強（P<0.05）。A549/GR的耐藥指數(shù)為13.4。Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，耐藥細胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細胞A549。IGF-1作用的A549細胞，p-AKT、ABCG2蛋白表達均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞，p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）。IGF-1作用A549細胞后，較未加入激活劑的A549細胞，其外排作用增強（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞后，較未加入激活劑的A549/GR細胞，其外排作用減少（P<0.05）。健康人的ABCG2表達明顯低于非小細胞肺癌非耐藥組患者（P<0.05），非小細胞肺癌吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達均高于非小細胞肺癌非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。結(jié)論 在非小細胞肺癌吉非替尼耐藥中ABCG2起到了重要的作用，逆轉(zhuǎn)ABCG2介導的NSCLC靶向耐藥主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路。

[關(guān)鍵詞] ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族G成員2;非小細胞肺癌;吉非替尼;耐藥;磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶

[中圖分類號] R979.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（b）-0009-05

肺癌是近年來發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-samll cell lung cancer，NSCLC）占80%～90%[1-2]。吉非替尼是第一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitor，EGFR-TKI）類藥物，是治療晚期NSCLC EGFR突變?nèi)巳旱氖滓x擇，但治療后大部分患者會產(chǎn)生獲得性耐藥[3-4]。ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族G成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）通過外排泵作用，促進細胞內(nèi)化療藥物主動外排，參與多種腫瘤耐藥機制[5-6]。既往研究表明[7-8]，耐厄洛替尼的人肺腺癌細胞株（A549/ER）相對于A549細胞株ABCG2表達升高，由于厄洛替尼與吉非替尼均屬于EGFR-TKI類藥物，但其藥理學特性不同，所以吉非替尼的耐藥亦可能與ABCG2有關(guān)。本課題通過對ABCG2在NSCLC吉非替尼耐藥中的作用及其介導耐藥的信號路徑的研究，對于吉非替尼耐藥的NSCLC的治療有重要意義，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞材料? 人非小細胞肺腺癌吉非替尼敏感細胞株A549購自上海復祥生物科技有限公司，吉非替尼耐藥非小細胞肺癌細胞株A549/GR由本實驗室誘導所得。

1.1.2 一般資料? 收集2015年4月～2017年4月我院收治的NSCLC患者及健康人的血清，分為NSCLC非耐藥組（20例）、NSCLC吉非替尼耐藥組（20例）和健康者組（20例）。NSCLC非耐藥組研究對象的年齡39～80歲;男7例，女13例;腺癌17例，鱗癌2例，腺鱗癌1例。NSCLC吉非替尼耐藥組研究對象的年齡43～76歲;男5例，女15例;腺癌19例，腺鱗癌1例。健康者組研究對象的年齡31～75歲，男9例，女11例。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核及同意。

1.1.3藥品與試劑? 吉非替尼購自阿斯利康公司（250 mg/片）。一抗：GAPDH（武漢博士德公司）;ABCG2（Abcam公司）;p-AKT（Abcam公司）;二抗：辣根過氧化物酶（漢博士德公司）;PRMI1640培養(yǎng)基及胎牛血（Hyclone公司）;MTT（Sigma公司）;ABCG2酶聯(lián)免疫分析試劑盒（cusabio公司）。Thermo Multikan MK3酶標儀（Thermo公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)? 將A549細胞株應用含10%胎牛血清的PRMI1640于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行養(yǎng)育。將A549/GR細胞株置于含有濃度為1 μmol/L吉非替尼的10%胎牛血清的PRMI1640，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗對象為對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 A549/GR細胞的耐藥性檢測? 將A549及A549/GR細胞分別加入100 μl呈半數(shù)藥物濃度梯度的培養(yǎng)基，各設置7個濃度梯度組（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）及空白對照組，培養(yǎng)后加入MTT，濃度5 mg/ml，培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），輕微振蕩后用酶標儀檢測吸光度（A）值（波長490 nm）。用下列公式進行計算：

細胞存活率=（實驗組A值/對照組A值）×100%，耐藥指數(shù)=耐藥細胞半抑制濃度（IC50）/親代細胞IC50

1.2.3 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR細胞的表達? 用吉非替尼分別處理A549、A549/GR，細胞裂解后，提取總蛋白，應用BCA法行蛋白定量。在120 V下持續(xù)電泳至樣品到達凝膠底部。半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后，剪下相應條帶，分別放入GAPDH、ABCG2、p-AKT多克隆一抗中（1∶1000稀釋），4℃冰箱孵育過夜。次日，將PVDF膜從一抗中取出，洗膜緩沖液（TBST）洗脫3次，置于二抗（1∶2000稀釋）中，于搖床上搖動，洗脫3次。最后將配好的電化學發(fā)光（ECL）液滴加覆蓋PVDF膜。使用超靈敏化學發(fā)光儀進行曝光，選擇合適曝光時間，觀察分析曝光的條帶情況。

用濃度為100 ng/ml的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及濃度為20 μmol/L的LY294002分別處理A549、A549/GR細胞48 h，用上述同樣方法檢測蛋白的表達。

1.2.4檢測細胞中ABCG2外排? 取A549細胞及A549/GR細胞作為對照，在A549細胞和A549/GR細胞中分別加入IGF-1、LY294002，將4組細胞各加入1 μg/ml Rh123培養(yǎng)24 h，使用流式細胞儀檢測ABCG2外排情況。

1.2.5檢測健康人、NSCLC非耐藥組及非小細胞肺癌吉非替尼耐藥組患者中ABCG2表達? 收集患者清晨空腹靜脈血，靜置取上層血清，按酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒操作說明，進行ELISA檢測血清中ABCG2水平。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組建比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 A549/GR細胞的耐藥性檢測

吉非替尼對A549細胞及A549/GR細胞的抑制作用，隨濃度的升高而增強（P<0.05）。濃度相同，A549/GR的細胞存活率高于A549細胞（圖1）。吉非替尼對A549/GR的IC50為47 μmol/L，吉非替尼對A549細胞的IC50為3.5 μmol/L，耐藥指數(shù)為13.4。

與同組前一個濃度比較，*P<0.05

2.2 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR細胞的表達

Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，耐藥細胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細胞A549（圖2）。

IGF-1作用的A549細胞、p-AKT、ABCG2蛋白表達提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞、p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）（圖3）。

2.3檢測細胞中ABCG2外排

IGF-1作用A549細胞后，較未加入激活劑的A549細胞，其外排作用增強（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞后，較未加入激活劑的A549/GR細胞，其外排作用減少（P<0.05）（圖4）。

2.4檢測健康人、NSCLC非耐藥組及NSCLC吉非替尼耐藥組患者中ABCG2表達

檢測健康人、NSCLC非耐藥組及NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達分別為（98.6±6.8）ng/ml、（209.5±8.2）ng/ml及（326.7±10.3）ng/ml。健康人的ABCG2表達明顯低于NSCLC非耐藥組患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達均高于NSCLC非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。

3討論

EGFR-TKI是目前晚期NSCLC EGFR突變患者的一線治療選擇，其耐藥機制已成為臨床研究的重點。早在1970年Biedler等[9]就首次報道腫瘤存在多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象。癌細胞多藥耐藥性形成的重要原因是ABC轉(zhuǎn)運體的異常表達[10-11]。人類基因組編碼ABC轉(zhuǎn)運體有49個，包括A～G 7個亞家族，其中最少有16個轉(zhuǎn)運體已被證實具有藥物外排功能[12]。ABCG2屬于ABC轉(zhuǎn)運體家族中的一員，最早是在乳腺癌耐藥細胞株中被發(fā)現(xiàn)，是一種半轉(zhuǎn)運體[13]。有研究證實ABCG2與吉非替尼、厄洛替尼等相結(jié)合可導致藥物主動外排到胞外，進而抑制其生物活性，產(chǎn)生耐藥[14-15]。本研究著重于探討ABCG2 在吉非替尼耐藥的非小細胞肺癌中作用及其調(diào)控耐藥的機制。

Ho等[16]從H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六種肺癌細胞系中分離出的側(cè)群細胞中ABCG2高表達。一項中國臺灣的研究顯示[17]，對于吉非替尼耐藥的EGFR野生型的非小細胞肺癌中，其耐藥與ABCG2相關(guān)，而且ABCG2表達過多可提示對吉非替尼的療效差。本研究結(jié)果提示，Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，耐藥細胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細胞A549，證明了耐藥細胞中ABCG2的表達要明顯高于正常腫瘤細胞（P<0.05）。與以上研究基本一致，但本課題缺乏對ABCG2影響腫瘤治療預后的研究，有待進一步的研究。

磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phpsphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）通路激活劑IGF-1可在體外激活PI3K/AKT信號通路，激活AKT活化，進而調(diào)控腫瘤細胞的生長、增殖，促進血管生成，提高腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[18-19]。PI3K/AKT通路抑制劑LY294002為一種高效的AKT激酶選擇性抑制劑，可使吉非替尼耐藥的非小細胞肺癌細胞株逆轉(zhuǎn)耐藥[20]。本研究利用加入PI3K/AKT通路激活劑和抑制劑的細胞通過RH123外排的檢測來明確ABCG2外排情況。研究結(jié)果提示，IGF-1作用的A549細胞，p-AKT、ABCG2蛋白表達均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞，p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）。IGF-1作用A549細胞后，較未加入激活劑的A549細胞，其外排作用增強（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細胞后，較未加入激活劑的A549/GR細胞，其外排作用減少（P<0.05）。提示PI3K/AKT激活劑和抑制劑可以調(diào)節(jié)Rh123的外排，故PI3K/AKT通路可能調(diào)節(jié)ABCG2的表達，與既往研究一致。

有報道[21-22]提示肺癌干細胞中ABCG2高表達，并與肺癌的耐藥相關(guān)。另外一項研究結(jié)果提示[23]，手術(shù)前后NSCLC患者的ABCG2的表達，可見未手術(shù)的NSCLC患者血清中ABCG2的表達高于健康人及術(shù)后患者。本研究結(jié)果提示，健康人的ABCG2表達明顯低于NSCLC非耐藥組患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達均高于NSCLC非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。證實ABCG2在NSCLC中要高于健康人群，吉非替尼耐藥的NSCLC的表達高于NSCLC的人群。由此研究可見，ABCG2可作為吉非替尼耐藥NSCLC的重要標記，對于預測耐藥及指導后續(xù)耐藥后治療至關(guān)重要。

綜上所述，ABCG2在NSCLC吉非替尼耐藥中起到了重要的作用，本實驗驗證了ABCG2可作為預測EGFR-TKI耐藥的重要指標，并證明了逆轉(zhuǎn)ABCG2介導的NSCLC 靶向耐藥主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，后在NSCLC的患者中驗證了這一推測，但本研究仍然具有一定的局限性，并沒有行亞組及ABCG2與非小細胞肺癌患者治療療效及生存期的分析，值得進一步的探討，為吉非替尼耐藥的NSCLC治療提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-11-20? 本文編輯：孟慶卿）