摘要：納米孔單分子分析技術(shù)是通過不同的壓力驅(qū)動分子通過納米孔，監(jiān)測分子易位時(shí)產(chǎn)生的電流變化。該技術(shù)快速，無需標(biāo)記和擴(kuò)增等相關(guān)方法，就能夠?qū)τ跈z測分析分子的性質(zhì)進(jìn)行檢測。隨之發(fā)展起來的納米孔測序技術(shù)可以將人類基因組測序成本控制在1000美元之內(nèi)。主要介紹了用于單分子分析的納米孔技術(shù)抗結(jié)核藥物異煙肼的檢測新方法。

關(guān)鍵詞：溶血素納米孔;單分子檢測;環(huán)糊精適配體;異煙肼

1個(gè)生物納米孔

1.1α-溶血素

金黃色葡萄球菌毒素（α-溶血素）是由金黃色葡萄球菌分泌的外毒素。它是研究得最徹底的生物納米孔，其形狀為蘑菇狀七聚體跨膜孔蛋白。它主要由兩部分組成：一部分是14個(gè)跨膜β-螺旋結(jié)構(gòu)鏈的帽狀結(jié)構(gòu)，入口直徑為2.6nm，中間直徑為3.6nm，前庭長約5nm，另一部分與前庭相連。桶形結(jié)構(gòu)長約5nm，直徑為2.2nm，最窄點(diǎn)僅為1.4nm。 α-溶血素自組裝在脂質(zhì)雙層膜上形成開放的納米孔，緩沖液中的陰離子和陽離子通過納米孔產(chǎn)生開放的離子電流;帶電的DNA分子由電壓驅(qū)動并通過納米孔產(chǎn)生阻斷電流，當(dāng)DNA分子完全通過時(shí)，離子電流恢復(fù)正常。由于當(dāng)前阻斷的時(shí)間與分子的性質(zhì)有關(guān)，因此DNA分子通過納米孔的易位事件和DNA分子的性質(zhì)可以通過當(dāng)前的變化來研究。由于其孔徑小，只允許單鏈DNA分子通過，因此它只能用于檢測較小直徑的分析物，如離子[9]，小分子，單鏈DNA和RNA 。

1.2 MspA

近年來，對恥垢分枝桿菌中孔蛋白MspA生物納米孔的研究越來越多。

這些結(jié)構(gòu)允許MspA很好地應(yīng)用于納米孔測序，特別是具有較短的孔和較小的孔徑，允許不同的核苷酸產(chǎn)生更容易區(qū)分的通過通道的特征阻斷電流。野生型MspA由于其頸部中的負(fù)電荷的富集而影響DNA分子的通過，因此通過突變實(shí)現(xiàn)負(fù)電荷或正電荷的消除，這增加了DNA的捕獲速率并降低了DNA穿孔的速率。將突變的MspA蛋白孔與Phi29 DNA聚合酶組合以控制單鏈DNA分子孔，如分子馬達(dá)。在聚合酶的作用下，待測DNA分子被消化到孔中，然后返回形成雙鏈，來回。在兩個(gè)通孔中都發(fā)生阻塞效應(yīng)，并且實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)測試，這提高了檢測的準(zhǔn)確性。

2個(gè)固態(tài)納米孔

2.1納米多孔膜材料

隨著納米孔技術(shù)的不斷更新，固體納米孔的制備材料也多樣化，主要使用最常見的Si3N4。這主要是由于其化學(xué)性質(zhì)，首先是穩(wěn)定性，不受電解質(zhì)濃度和pH的影響。溫度的價(jià)值和影響;第二，它是絕緣的，在受到高強(qiáng)度電場作用時(shí)不會被破壞;它還具有良好的表面特性，有利于納米孔的表面改性或功能組裝[38]。近年來出現(xiàn)的石墨烯納米孔也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。石墨烯的優(yōu)異化學(xué)，電學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)，特別是單層石墨烯（0.32～0.52nm）的厚度，使納米孔通道的長度大大縮短。它可以減少DNA分子易位時(shí)產(chǎn)生的噪音，并且可以更準(zhǔn)確地識別通過DNA分子的物理化學(xué)特性，這可以更好地應(yīng)用于DNA測序。

2.2納米孔制備方法

與天然納米多孔材料不同，良好的固態(tài)納米孔裝置的制備需要開發(fā)各種微納加工技術(shù)。自李等人。 2001年發(fā)表了離子束制備納米孔的方法，報(bào)道了各種納米孔制備方法，包括電子束刻蝕，離子束刻蝕和氦離子刻蝕，電子束收縮和濕法刻蝕。和其他方法。更常見的方法是離子束蝕刻和電子束蝕刻。

2.3納米電極

基于隧穿電流原理，研究人員開始在孔隙中制備納米孔，其中集成了納米電極，用于檢測單分子易位事件，同時(shí)能夠獲得橫向和縱向的二維電流信號。方向，實(shí)現(xiàn)多維度，準(zhǔn)確性和檢測。靈敏度。由于每個(gè)堿基的最高和最低占據(jù)分子軌道間隙不同，堿基具有獨(dú)特的隧穿電流信號，因此可以精確地區(qū)分DNA的四個(gè)堿基。

3.復(fù)合納米孔

固態(tài)納米孔制備技術(shù)相對成熟，但制備較小孔徑的納米孔更加困難。當(dāng)分析物的物理性質(zhì)相似時(shí)，無法區(qū)分它們。在諸如單分子檢測的應(yīng)用中，需要適當(dāng)?shù)匦揎椉{米孔的表面以形成復(fù)合納米孔，以提高特定分子的檢測靈敏度。例如改變固體納米孔的尺寸，材料表面的性質(zhì)（表面電荷，極性）等，使得功能性固體納米孔可以選擇性地輸送物質(zhì)?；瘜W(xué)改性，例如烷基，羧基，硫醇改性，可以直接改變材料表面的物理性質(zhì)，將官能團(tuán)連接到材料表面。生物分子修飾，例如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸等，在固體納米孔上的一層流動的脂質(zhì)雙層，其區(qū)分各種蛋白質(zhì)分析物并防止α-溶血素納米顆粒中肽的過度擁擠?？椎摩?桶的底部突變形成氨基酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)上的半胱氨酸通過二硫鍵與寡聚DNA結(jié)合形成較長的雙鏈DNA的陰離子尾，可以電泳移位。 α-溶血素納米孔固定固定在固體納米孔上，實(shí)現(xiàn)了生物納米孔與固體納米孔的結(jié)合，為納米孔的基因組測序提供了原始芯片。

結(jié)束語

納米孔技術(shù)已應(yīng)用于抗結(jié)核藥物異煙肼的檢測醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，但研究人員仍有一些技術(shù)瓶頸需要解決，如隨機(jī)穿過納米孔的分子的軌跡控制，分子通過納米孔的速度。納米孔和高質(zhì)量的納米孔。需要克服批量準(zhǔn)備，數(shù)據(jù)后整理分析和導(dǎo)出等問題。解決了這些問題后，納米孔測序?qū)?shí)現(xiàn)測序吞吐量的指數(shù)級增長，成本控制在1000美元以內(nèi)的目標(biāo)即將到來。其快速而廉價(jià)的測序能力將引領(lǐng)我們進(jìn)入比較基因組學(xué)分析，疾病診斷和個(gè)性化醫(yī)療等新領(lǐng)域。