馮惠敏 王周平 徐德平

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

益智為姜科山姜屬(Alpinia)植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)的干燥成熟果實(shí)，又稱益智仁或益智子，主要分布于中國海南、廣東、廣西等省份，是一種安全性高的藥食兩用植物資源。中醫(yī)認(rèn)為其具有溫脾止瀉攝唾，暖腎固精縮尿的功效，臨床上用于治療虛寒腹瀉、遺尿等多種疾病[1-2]。藥理研究表明該植物具有止瀉、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗炎[3]、神經(jīng)保護(hù)[4-6]等作用。益智仁含有豐富的化學(xué)成分，具有多種藥理活性，近年來，中國越來越多的學(xué)者對(duì)益智仁縮尿功效進(jìn)行了研究，并取得了新的進(jìn)展。黃勤挽等[7-8]研究表明，將益智仁和食鹽協(xié)同入藥，可顯著降低正常小鼠尿量。據(jù)龔曉猛等[9]報(bào)道，益智仁縮尿功效的藥效部位為揮發(fā)油或石油醚提取部位，但關(guān)于益智仁縮尿功效的活性成分未見報(bào)道。基于此，本試驗(yàn)擬對(duì)益智仁縮尿功效的化學(xué)成分展開了系統(tǒng)研究，旨在闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探究主要化學(xué)成分，為日后益智仁的研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

益智仁：購于安徽亳州中藥市場(chǎng)；

ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄性，上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

柱層析硅膠：100 目，青島海洋化工公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺(tái)芝罘化工廠；

Middle Chromatogram Osolated Gel(MCI GEL)填料：三菱化學(xué)有限公司；

Octadecylsily(ODS)填料：日本YMC公司；

試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

磨粉機(jī)：GLF-205型，浙江省溫州市創(chuàng)立藥材器械廠；

萃取罐：RAT-100型，無錫申科儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，江蘇省金壇市榮華儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-1002型，上海申順生物科技有限公司儀器廠；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術(shù)公司；

暗室紫外投射儀：ZF-90型，上海顧順電光儀器廠；

可見分光光度計(jì)：WFJ 2000型，優(yōu)尼柯上海儀器有限公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，布魯克(北京)科技有限公司；

小鼠代謝籠：SA106型，江蘇賽昂斯生物科技。

1.2 方法

1.2.1 益智仁提取物的制備 稱取10 kg益智仁，粉碎后過80 目篩，按照料液比1∶10 (kg/L)加入75%的無水乙醇，置于100 L萃取罐中，50 ℃條件下攪拌提取3 h，過濾，取濾液減壓濃縮[10]。濾渣按上述方法反復(fù)提取2次，合并3次提取液減壓濃縮至適宜體積，即為益智仁乙醇提取物，并于-20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆?。按照上述提取方法，向益智仁醇提后濾渣中加入100 L去離子水，并于60 ℃ 條件下攪拌3 h，重復(fù)提取2次，過濾取濾液減壓濃縮至浸膏狀，即得益智仁水提物，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量益智仁乙醇提取物于1 000 mL分液漏斗中，依次按照1∶1 (mL/mL)比例加入乙酸乙酯、正丁醇，小心倒置震蕩，使其充分混勻，反復(fù)萃取3次，得到乙酸乙酯萃取物(A)、正丁醇萃取物(B)和萃取剩余相(C)，分別減壓濃縮至油膏狀，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩０创妓?∶1 (mL/mL)向水提物中緩慢加入無水乙醇，并不斷攪拌使?jié)饪s液充分醇沉，至酒精濃度達(dá)到70%以上，靜置過夜，過濾得濾液相(D)減壓濃縮至膏狀，醇沉相(E)充分干燥，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 益智仁不同組分縮尿活性

(1) 單純水負(fù)荷小鼠模型建立：采用3周齡SPF級(jí)ICR雄性小鼠60只，體重18～22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，觀察小鼠狀態(tài)，并隨機(jī)分成6 組(分別為空白對(duì)照組K和試驗(yàn)組A、B、C、D、E)，每組10 只。經(jīng)口給藥，每天1 次，連續(xù)2周。經(jīng)小鼠縮尿預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)組灌胃劑量確定為1 g/(kg·d)，空白對(duì)照組給等體積飲用水。試驗(yàn)前18 h禁食不禁水，末次給藥(或水)1 h后按0.6 mL/20 g體重灌胃純水作為水負(fù)荷，充分?jǐn)D盡膀胱內(nèi)尿液[11]。

(2) 尿量收集：使用200 μL移液槍，收集代謝籠中每只小鼠的尿液，置于1.5 mL離心管中。準(zhǔn)確稱量并記錄前2 h尿重及6 h總尿重后，于-20 ℃冷凍保存。

1.2.3 益智仁縮尿功效的成分分離及鑒定

(1) 乙酸乙酯萃取物的分離：經(jīng)1.2.2小鼠縮尿試驗(yàn)確定，對(duì)具有縮尿功效的乙酸乙酯萃取物(A)進(jìn)一步分離。取適量乙酸乙酯萃取物，上樣到MCI 柱(D 5 cm ×100 cm)，依次用體積分?jǐn)?shù)為 50%，70%，80%，95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，分別得到P1(50%洗脫)、P2(70%洗脫)、P3(80%洗脫)、P4(95%洗脫)4個(gè)部分，分別減壓濃縮后于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) P1、P2、P3和P4的縮尿功效：按1.2.2益智仁小鼠縮尿試驗(yàn)方法，確定乙酸乙酯萃取物經(jīng)MCI柱分離得到的P1、P2、P3和P4 4個(gè)組分的縮尿功效。其中，試驗(yàn)組小鼠均按1 g/(kg·d)劑量給藥，灌胃體積為0.1 mL/10 g。

(3) 單體化合物的的分離及鑒定：將具有縮尿功效的P3、P4樣品分別反復(fù)通過ODS-D(D 3 cm ×100 cm)、ODS-AQ(D 3 cm×100 cm)色譜柱進(jìn)行分離，自動(dòng)收集器收集洗脫液(15 mL/管)，TLC法跟蹤檢測(cè)洗脫液成分，將顯色反應(yīng)和Rf值一致的洗脫液合并，最終得到4個(gè)單體化合物。用CDCl3為溶劑，經(jīng)1H NMR和13C NMR等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其純度和結(jié)構(gòu)。

(4) 單體化合物Ⅰ、Ⅱ的縮尿功效：按1.2.2益智仁小鼠縮尿試驗(yàn)方法，確定單體化合物Ⅰ、Ⅱ2個(gè)單體化合物的縮尿功效。試驗(yàn)組小鼠均按1 g/(kg·d)劑量給藥，灌胃體積為0.1 mL/10 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 益智仁提取物縮尿功效

益智仁提取物對(duì)小鼠尿量的影響見表1。

由表1可知，前2，6 h尿量/體重，只有A組小鼠較空白對(duì)照組相比顯著下降(P<0.01)，說明A樣品中存在具有縮尿功效的成分。而且前2 h顯著減少也說明了A樣品能在短期內(nèi)快速對(duì)尿量的產(chǎn)生起到抑制作用。其他4組小鼠的尿重/體重在前2，6 h內(nèi)較空白對(duì)照組均無明顯改善，故表明不含縮尿活性成分。

2.2 乙酸乙酯萃取物不同組分縮尿功效

乙酸乙酯萃取物不同組分對(duì)小鼠尿量的影響見表2。

由表2可知，前2 h內(nèi)，P3組小鼠較空白對(duì)照組尿量/體重顯著下降(P<0.05)，P4組小鼠較空白對(duì)照組尿量/體重下降趨勢(shì)比P3更為顯著(P<0.01)。6 h總尿量和體重比結(jié)果表明，P4組較空白組仍有顯著下降差異(P<0.01)，得出P3、P4組均含有具有縮尿功效的成分，并能在短期內(nèi)快速對(duì)尿量的產(chǎn)生起到抑制作用。P1、P2組小鼠的尿重/體重在前2，6 h內(nèi)與空白組相比均無明顯差異，說明該部分沒有縮尿活性成分。

表1 益智仁提取物對(duì)小鼠尿量影響?

? 與空白對(duì)照組比較，** P<0.01。

表2 乙酸乙酯萃取物不同組分對(duì)小鼠尿量的影響?

? 與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；** P<0.01。

通過ODS-D(D 3cm ×100 cm)、ODS-AQ(D 3 cm×100 cm)色譜柱分離， TLC法跟蹤檢測(cè)，最終，從P3樣品中分離得到化合物Ⅰ，從P4樣品分離得到化合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。

2.3 乙酸乙酯萃取物中化合物的鑒定

化合物Ⅰ、Ⅱ的13C核磁共振數(shù)據(jù)見表3、4，化合物Ⅰ、Ⅱ的結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物Ⅰ為黃色油狀物，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。

從1HNMR(CDCl3，500 MHz)可見：δ6.69(2H，m)和δ6.57(1H，J=10.5)為一組1,3,4-三取代苯環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)，δ7.20～7.06(5H，m)為一組單取代苯環(huán)上得到質(zhì)子信號(hào)；δ3.74(3H，s)為甲氧基質(zhì)子信號(hào)，δ1.45～2.72，為6個(gè)—CH2— 氫信號(hào)。

從13C-NMR可見：該化合物共有19個(gè)碳信號(hào)，低場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)9個(gè)碳信號(hào)，其中有6個(gè)為1,3,4-三取代苯環(huán)上的碳信號(hào)，化學(xué)位移分別為δ134.2，113.3，148.9，145.9，116.3，121.9，其他3個(gè)為單取代苯環(huán)上的碳信號(hào)，化學(xué)位移分別為δ143.6，129.6，126.9，δ56.5為1個(gè)甲氧基碳信號(hào)，結(jié)合135DEPT 得知δ45.5，43.7，36.8，32.2，30.7，24.5為6個(gè)亞甲基上的碳信號(hào)。

從135DEPT可見：該化合物有1個(gè)雙鍵信號(hào)，δ56.6為1個(gè)—OCH3碳信號(hào)，δ24.5～45.5為6個(gè)—CH2—碳信號(hào)。結(jié)合以上光譜分析，得出化合物1為3-甲氧基-4羥基-二苯己烷，該化合物為益智仁中首次發(fā)現(xiàn)。

化合物Ⅱ?yàn)辄S色顆粒狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。

從1HNMR(CDCl3，500 MHz)可見：δ：5.36(1H，s)，δ：3.53(1H，s)，δ：1.18(1H，s)，δ：1.25(1H，s)，δ：1.45(1H，s)，δ：1.56(1H，s)，δ：1.65(1H，s)，δ：1.84(1H，s)，δ：1.95(1H，s)，該化合物含有1個(gè)連氧氫，出現(xiàn)在較低場(chǎng)區(qū)的信號(hào)δ2.29～1.06是環(huán)狀烷烴上的—CH2—?dú)湫盘?hào)。

從13C-NMR可見：該化合物共有32個(gè)碳信號(hào)，其中δ140.8和δ121.6為二個(gè)烯碳信號(hào)，表明化合物含有1個(gè)雙鍵，δ71.7為1個(gè)連氧碳信號(hào)，δ11～56為29個(gè)碳信號(hào)。

從135DEPT可見：該化合物有1個(gè)雙鍵信號(hào)，δ11.8～19.8 為7個(gè)—CH3碳信號(hào)，δ21.1～42.2為15個(gè)—CH2—碳信號(hào)，δ28.2～50.2為6個(gè)—CH—碳信號(hào)。

從以上信息可得，該化合物為甾醇類化合物，與相關(guān)文獻(xiàn)[12]比較，母環(huán)部分與β-谷甾醇數(shù)據(jù)基本一致，不同的是該化合物含有32個(gè)碳信號(hào)，則多余的3個(gè)碳信號(hào)形成一個(gè)丙基，從母環(huán)上可以看出C-20本應(yīng)該是1個(gè)—CH—信號(hào)，但在NMR數(shù)據(jù)中未見該信號(hào)，而在δ31.9處出現(xiàn)1個(gè)季碳信號(hào)，因此判斷丙基應(yīng)連接在C-20位上。最終得出該化合物為20-丙基-β-谷甾醇，并且該化合物在益智仁中首次分離得到。

化合物Ⅲ為亞油酸，化合物Ⅳ為油酸。

表3 化合物Ⅰ的13C核磁共振數(shù)據(jù)

表4 化合物Ⅱ的13C核磁共振數(shù)據(jù)

圖1 化合物Ⅰ和Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 單體化合物的縮尿功效

化合物Ⅰ、Ⅱ?qū)π∈竽蛄康挠绊懸姳?。

由表5可知，前2 h內(nèi)，Ⅰ、Ⅱ組小鼠較空白對(duì)照組尿量/體重下降極顯著(P<0.01)。對(duì)6 h總尿量和體重比進(jìn)行測(cè)定，Ⅰ組小鼠較空白對(duì)照組尿量/體重下降顯著(P<0.05)，但Ⅱ組較Ⅰ組下降趨勢(shì)更為顯著(P<0.01)，得出化合物Ⅰ和化合物Ⅱ均具有縮尿的功效，且化合物Ⅱ效果更明顯。同時(shí)二者能在短期內(nèi)快速對(duì)尿量的產(chǎn)生起到抑制作用。

表5 不同單體化合物對(duì)小鼠尿量的影響?

? 與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；** P<0.01。

3 結(jié)論

益智仁乙醇提取物乙酸乙酯萃取相經(jīng)MCI柱分離，80%和95%乙醇洗脫物對(duì)小鼠縮尿有顯著作用，從這2個(gè)洗脫物中分離得到4種單體化合物，分別為3-甲氧基-4羥基-二苯己烷、20-丙基-β-谷甾醇、油酸和亞油酸，前2個(gè)化合物均為首次報(bào)道。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知油酸、亞油酸不具有縮尿的功效，因而可以得出3-甲氧基-4羥基-二苯己烷和20-丙基-β-谷甾醇為益智仁中具有縮尿作用的主要功效成分，這與文獻(xiàn)[13]報(bào)道益智仁中具有縮尿作用的化合物為二苯庚烷類化合物的結(jié)果不一致。同時(shí)結(jié)果表明，20-丙基-β-谷甾醇的縮尿效果較優(yōu)于3-甲氧基-4-羥基-二苯己烷。通過研究，本試驗(yàn)確定了益智仁中具有縮尿作用的2種單體化合物，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，分析二者可能是通過某種途徑調(diào)節(jié)了膀胱逼尿肌的收縮和舒張，增加了膀胱的容量，從而達(dá)到減少尿量的作用，因此二者在體內(nèi)通過何種途徑發(fā)揮縮尿作用及其作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。