劉 星，代 穎，李和偉，呂景晶

皮膚的主要功能是作為天然屏障阻隔人體與外界的接觸[1]。其表面棲息著大量的微生物群，分為常駐菌群與暫住菌群[2]。常駐菌群主要包括葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、微球菌屬、棒狀桿菌屬等，而暫住菌群主要是通過接觸外界獲得。常駐菌群在皮膚表面形成生物膜，一方面具有占位保護效應，作為物理屏障阻擋外源性致病菌的入侵；另一方面還可通過產(chǎn)生抗菌肽而抑制或殺滅病原菌[3]。皮膚表面的微生物、宿主及外環(huán)境三者的相互作用形成了皮膚微生態(tài)環(huán)境[4]。影響皮膚微生態(tài)平衡的因素很多，如皮脂腺濃度、水分含量、溫度，以及遺傳和環(huán)境因素等[5,6]。生態(tài)平衡被打破時，可引起脂溢性皮炎、痤瘡、銀屑病等皮膚問題[7,8]。

目前，化妝品、面膜受到廣大人群尤其是女性的青睞，為了保證化妝品的貨架期和穩(wěn)定性，會在配方中添加防腐劑。許多研究發(fā)現(xiàn)化妝品中的防腐劑是引起消費者皮膚不良反應的原因之一[9-11]，如甲醛及甲醛釋放劑類的防腐劑、卡松類防腐劑（指5-氯-2甲基-4異噻唑啉-3酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮混合物，簡稱CIT/MIT）、硫柳汞等。蔡穎[12]的研究發(fā)現(xiàn)，尼泊金甲酯防腐劑能對皮膚的常駐菌群丙酸桿菌和表皮葡萄球菌產(chǎn)生一定的抑殺作用。相對于普通化妝品，面膜產(chǎn)品的防腐劑使用量約為普通化妝品的20～50倍（例：面霜每次使用量為0.5～1 g即可勻面；面膜一般每貼為25 g，甚至更多，總液體量增大20～50倍。因此假如同樣添加0.5%防腐劑，由于總液體量增大了20～50倍，因此防腐劑的使用量也增大了20～50倍）。因此若防腐劑干擾面部皮膚的菌群微生態(tài)，對于消費者的皮膚微健康而言將存在很大隱患。

本文以某市售含防腐劑面膜產(chǎn)品為研究對象，跟蹤研究了持續(xù)使用以及停用后，含防腐劑面膜產(chǎn)品對皮膚表面菌群的影響。同時設計出一款同配方但去掉防腐劑的面膜，并針對該未含防腐劑的面膜是否會對皮膚表面菌群產(chǎn)生不良影響同樣進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 受試者選擇 招募健康肌膚受試者20人（男6人、女14人），年齡25～35歲，剔除各種程度的皮炎、痤瘡、青春痘等受試者。對受試者進行隨機分組，分為兩組（受試組1和試驗組2）。所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 面膜配方 受試組1和試驗組2均選用基礎配方完全相同的兩種面膜：去離子水（添加比例至100%），甘油（3%），透明質(zhì)酸鈉（0.05%），增稠劑（0.2%），丁二醇（2%），植物提取液（5%），氨丁三醇（0.05%），其區(qū)別僅在于受試組2使用的面膜還包含了由3種防腐劑[尼泊金甲酯（0.1%），雙（羥甲基）咪唑烷基脲（0.25%），碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（0.01%）]組成的防腐體系。

1.2 方法

1.2.1 取樣方法 所有受試者在首次使用面膜前于鼻翼側至臉頰部位約10 cm2范圍取樣，取樣時使用棉球浸泡在滅菌后的生理鹽水中，擦拭皮膚取樣部位后將棉球置于9 ml生理鹽水中浸潤，充分震蕩搖勻后分別取1 ml加入到無菌培養(yǎng)基中。面膜的使用時間為上午9:00～10:00，單次使用時間15 min。使用后不潔面，使面膜精華液自然吸收，4 h后取樣、培養(yǎng)。每名受試者于使用前測試初始值（0次），并開始每日使用1片面膜，無防腐劑受試組連續(xù)使用8 d面膜，防腐劑受試組連續(xù)使用4 d后停用4 d，并每日對兩組受試者進行取樣及菌種培養(yǎng)。

1.2.2 菌種培養(yǎng)與鑒別 各菌種種屬通過細菌生化鑒定管（青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司）鑒定。各菌種培養(yǎng)條件及計數(shù)方法見表1。

表1 實驗菌種培養(yǎng)條件

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS24.0進行分析。同條件兩受試組初始菌群數(shù)據(jù)差異性分析采用獨立樣本t檢驗，不同條件兩受試組各菌群種群動態(tài)趨勢分析采用線性回歸法、不同條件兩受試組各菌群種群動態(tài)趨勢差異性分析采用單變量多因素方差分析法。

2 結果

2.1 兩組受試人群面頰部菌群初始狀態(tài)相似性分析

在實驗開始前，對兩組受試人群面頰部進行取樣、菌種培養(yǎng)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計（表2）。根據(jù)表2對兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗（表3），針對菌種和人群分組以及統(tǒng)計數(shù)量進行雙因素方差分析（表4）。由此可見，數(shù)據(jù)滿足方差齊性（P=0.167＞0.05），根據(jù)齊性方差的顯著性雙尾檢驗顯示兩組受試人群的面頰部菌群在初始時差異無統(tǒng)計學意義（P=0.975＞0.05），面頰部皮膚表面的菌落、菌群數(shù)量相似。對各菌群間進行雙因素方差分析，結果顯示差異無統(tǒng)計學意義（P=0.293＞0.05），人個體的不同對菌種和菌群數(shù)量無顯著影響（P=0.969＞0.05，P=0.225＞0.05）。因此，兩組人群在初始狀態(tài)具有相似性，受試組1使用含防腐劑面膜，試驗組2使用無防腐劑面膜，進行后續(xù)實驗以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對比菌群動態(tài)差異。

表2 兩組受試者面頰部各菌群初始數(shù)量統(tǒng)計

表3 兩組受試者面頰部菌群數(shù)量差異分析

表4 兩組受試者5個菌種的雙因素方差分析

2.2 無防腐劑面膜測試組菌群動態(tài)

試驗期間，每日對使用無防腐劑面膜組受試者進行面頰部取樣、菌種培養(yǎng)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計，種群動態(tài)變化見圖1。在連續(xù)使用無防腐劑面膜8 d后，受試者面頰部表皮葡萄球菌菌落數(shù)由49.50 CFU/ml降為40.17 CFU/ml；乳酸桿菌菌落數(shù)由46.83 CFU/ml增加到70.33 CFU/ml；金黃色葡萄球菌由45.17 CFU/ml降為CFU/ml；丙酸桿菌菌落數(shù)由72.83 CFU/ml降為33.67 CFU/ml；微球菌屬菌落數(shù)由27.17 CFU/ml降為15.17 CFU/ml。受試人員在8 d試驗期間，面部皮膚未出現(xiàn)任何異常狀況。

圖1 連續(xù)使用無防腐劑面膜受試者面頰部菌群種群動態(tài)圖

圖2 連續(xù)使用含防腐劑面膜受試者面頰部各菌群種群動態(tài)圖

2.3 含防腐劑面膜測試組菌群動態(tài)

試驗期間，每日對使用含防腐劑面膜組受試人員進行面頰部取樣、菌種培養(yǎng)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計，種群動態(tài)見圖2。

在連續(xù)使用含防腐劑面膜4 d后，受試人員的面頰部表皮葡萄球菌菌落數(shù)由55.25 CFU/ml降為0.67 CFU/ml；乳酸桿菌菌落數(shù)由92.33 CFU/ml降為1.25 CFU/ml；金黃色葡萄球菌由22.00 CFU/ml降為0.75 CFU/ml；丙酸桿菌菌落數(shù)由58.08 CFU/ml降為1.75 CFU/ml；微球菌屬菌落數(shù)由16.67 CFU/ml降為0.50 CFU/ml。

停止使用含防腐劑面膜4 d后，受試人員面頰部表皮葡萄球菌菌落數(shù)增加至15.92 CFU/ml；乳酸桿菌菌落數(shù)增加至33.17 CFU/ml；金黃色葡萄球菌菌落數(shù)增加至20.83 CFU/ml；丙酸桿菌菌落數(shù)增加至30.67 CFU/ml；微球菌菌落數(shù)增加至22.08 CFU/ml?？梢?，停止使用含防腐劑面膜后，菌群總體呈現(xiàn)恢復、增長的趨勢，但仍未能恢復至測試前的初始數(shù)值。

2.4 兩組受試者面頰部菌群對比分析

2.4.1 兩受試組人員面頰部表皮葡萄球菌種群變化趨勢對比 連續(xù)使用面膜4 d后，兩組受試者面頰部表皮葡萄球菌均降低，且降低趨勢差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.011＜0.05）（表5，圖3）。

表5 兩組受試者面頰部表皮葡萄球菌種群數(shù)量趨勢差異性分析

2.4.2 兩組受試者面頰部丙酸桿菌種群變化趨勢對比連續(xù)使用面膜4 d后，兩組受試者面頰部丙酸桿菌菌群數(shù)量均降低，降低趨勢差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.037＜0.05）（表6，圖 4）。

2.4.3 兩組受試者面頰部乳酸桿菌種群變化趨勢對比 連續(xù)使用面膜4 d后，兩組人員的面頰部乳酸桿菌菌群數(shù)量均降低，且降低趨勢差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.005＜0.01）（表 7，圖5）。

圖3 兩組受試者面頰部表皮葡萄球菌種群數(shù)量趨勢線性回歸圖

表6 兩組受試者面頰部丙酸桿菌種群數(shù)量趨勢差異性分析

圖4 兩組受試者面頰部丙酸桿菌種群數(shù)量趨勢線性回歸圖

2.4.4 兩組受試者面頰部金黃色葡萄球菌種群變化趨勢對比 連續(xù)使用面膜4 d后，兩組人員的面頰部金黃色葡萄球菌菌群數(shù)量均降低，且降低趨勢差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.026＜0.05）（表8，圖6）。

2.4.5 兩組受試者面頰部微球菌種群變化趨勢對比連續(xù)使用面膜4 d后，兩組人員的面頰部微球菌菌群數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.09＞0.05）（表9，圖7）。

使用含防腐劑的面膜組，持續(xù)使用4 d后，人體面頰部菌落總數(shù)顯著降低，同時金黃色葡萄球菌及丙酸桿菌占比增加；停用4 d后，菌落總數(shù)有所回升，但未達到初始水平，各菌種分布比例也未達到初始比例；使用未含防腐劑的面膜組，持續(xù)使用4 d后，人體面頰部菌落總數(shù)和菌群比例較初始值均無顯著變化。比較兩組種群數(shù)量動態(tài)以及各菌種比例分布，除微球菌外，均差異具有統(tǒng)計學意義。防腐劑對于微生態(tài)的擾動影響巨大，且恢復時間較長。

表7 兩組受試者面頰部乳酸桿菌種群數(shù)量趨勢差異性分析

圖5 兩組受試者面頰部乳酸桿菌種群數(shù)量趨勢線性回歸圖

表8 兩組受試者面頰部金黃色葡萄球菌種群數(shù)量趨勢差異性分析

圖6 兩組受試者面頰部金黃色葡萄球菌種群數(shù)量趨勢線性回歸圖

表9 兩組受試者面頰部微球菌種群數(shù)量趨勢差異性分析

圖7 兩組受試者面頰部微球菌種群數(shù)量趨勢線性回歸圖

3 討論

近年來隨著對表皮微生物的深入認識，人們越來越多的開始從生態(tài)學的角度來探討皮膚微生態(tài)中不同菌群與人體的相互關系。有研究發(fā)現(xiàn)特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）的發(fā)病機制中，微生物屏障的破壞實際就是皮膚菌群的失調(diào)。發(fā)病期間，皮膚菌群多樣性顯著下降，金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著上升，并與疾病的嚴重程度密切相關，且抗菌肽與防御素含量顯著下降[13-15]。Fitz等[16]提取了49例痤瘡患者和50名健康人鼻部皮脂腺中痤瘡丙酸桿菌的16S rDNA序列，發(fā)現(xiàn)RT4和RT5型痤瘡丙酸桿菌與痤瘡患者密切相關。

目前化妝品中使用頻率較高的防腐劑有苯甲酸及其酯類、溴硝丙二醇、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯、1，3-二甲羥甲基二甲基乙內(nèi)酰脲等，但對于這些常見防腐劑有研究表明其對人體具有一定的負面影響。如1，3-二甲羥甲基二甲基乙內(nèi)酰脲釋放出游離的甲醛，長期大量接觸具有致癌效果，許多行業(yè)已經(jīng)限量或禁止使用[17]；歐盟的新法規(guī)中，禁用異丁酯，甲酯丙酯限量由0.8 降到0.19；丹麥禁止在3歲以下兒童產(chǎn)品中加入尼泊金酯類防腐劑等[18]。根據(jù)《化妝品安全技術規(guī)范》（2015版），我國對于化妝品中準用的防腐劑種類已從56種減少為51種，并對用量與使用范圍作出了更為嚴格的規(guī)定，體現(xiàn)出減少防腐劑在化妝品中使用的趨勢。

本研究同樣發(fā)現(xiàn)，持續(xù)使用含防腐劑的面膜產(chǎn)品可使面頰部菌群多樣性發(fā)生顯著變化，使得皮膚常駐菌群表皮葡萄球菌、以及有益菌乳酸桿菌的占比顯著降低，而金黃色葡萄球菌的占比顯著增加。使用無防腐劑的面膜產(chǎn)品則對面頰部菌群微生態(tài)無顯著影響。表明防腐劑的添加是導致面頰部菌群微生態(tài)擾動的因素之一。

近年來，化妝品行業(yè)中出現(xiàn)了益生元生物制品類，主要是利用益生菌在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)調(diào)整皮膚菌群微生態(tài)起到護膚效果。市售產(chǎn)品如：SK-Ⅱ“神仙水”中的“Pitera”成分是一種復膜孢酵母代謝產(chǎn)物；雅詩蘭黛“小棕瓶”眼霜中主打的“Bi fi da”成分也是一種二裂酵母發(fā)酵物質(zhì)；超聲破碎乳酸菌得到的中性鞘磷脂酶可以治療特應性皮炎、銀屑病、魚鱗病等皮膚疾病[19]。這些物質(zhì)可起到提高表面皮膚益生菌菌群活性、抑制有害菌群的生長作用，進而達到調(diào)節(jié)皮膚生理活動、延緩皮膚細胞衰老的效果[20]。

因此，對于面膜類的產(chǎn)品，安全性與功效性同等重要，減少、甚至不再添加防腐劑，推薦人們使用減少、甚至不含防腐劑的面膜產(chǎn)品，同時從微生態(tài)調(diào)節(jié)的角度對添加成分進行優(yōu)化，將對產(chǎn)品安全性和功效性的提高具有廣泛的應用價值。