陳玉娟，熊心猜，張 浩，唐芹芹

動(dòng)物源性皮膚癬菌病是由皮膚癬菌感染引起的人獸共患疾病，治療皮膚癬菌病的藥物主要為非多烯類、唑類、丙烯胺類等藥物，各種菌對(duì)藥物的敏感性不同。本試驗(yàn)對(duì)已收集并經(jīng)鑒定確診為動(dòng)物源性皮膚癬菌病的皮膚癬菌[1]為目標(biāo)株，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）M38-A2方案[2]，選擇灰黃霉素（GRI）、伊曲康唑（ICZ）、特比萘芬（TBF）、氟康唑（FCZ）為實(shí)驗(yàn)藥物，對(duì)分離的皮膚癬菌進(jìn)行抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)臨床常見抗真菌藥物的敏感性，為臨床選藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2013年10月—2014年11月就診于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科的患者，有明確動(dòng)物接觸史，經(jīng)鑒定人與動(dòng)物由同一種皮膚癬菌致病，確診為動(dòng)物源性皮膚癬菌病32例患者的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)，并以微衛(wèi)星序列（GACA）4、NTS1、NTS2為引物行分子生物學(xué)方法鑒定，共分離出3種皮膚癬菌，包括21株犬小孢子菌、6株須癬毛癬菌復(fù)合體和5株石膏樣小孢子菌。

1.1.2 藥物 GRI（東京化工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：QR3KJ-JK，純度＞97.0%）；ICZ（東京化工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：IRNNI-CR，純度＞98.0%）；FCZ（東京化工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：QAGTF-LQ，純度＞98.0%）；TBF（美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S1101A，純度＞98.5%）。FCZ是水溶性藥物，在無菌操作下用滅菌蒸餾水溶解，藥物濃度的范圍配成0.125 0 ～ 64.000 0 μg/ml；GRI、ICZ、TBF 是 脂 溶性藥物，溶于100%的二甲基亞砜（DMSO），藥物濃度的范圍為 ：GRI與 ICZ 0.031 3 ～ 16.000 0 μg/ml，TBF 0.001 0～0.500 0 μg/ml。且DMSO的最終濃度不能超過1%，以免抑制真菌活性。

1.1.3 主要試劑與儀器 沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA培養(yǎng)基）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、RPMI 1640（含谷氨酰胺，不含酚紅）、DMSO、3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS）、聚山梨酸20、氫氧化鈉（NaOH）。96孔培養(yǎng)板（U型底）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、放大鏡、超凈工作臺(tái)（AIRTECH,JPN），電熱恒溫培養(yǎng)箱（重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠）、光學(xué)顯微鏡（Olympus company，JPN）。

1.1.4 質(zhì)控菌株 須癬毛癬菌復(fù)合體 ATCC-4439和紅色毛癬菌 ATCC-4438，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 取質(zhì)控菌株和已純化的目標(biāo)菌株，轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d活化真菌。將已活化菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。采用M38-A2方案[2]及相關(guān)文獻(xiàn)[3,4]的方案制備菌懸液，將2 ml含有0.1%聚山梨酸20的0.85%無菌鹽水覆蓋菌落，用無菌試紙輕刮菌落表面使孢子脫落，反復(fù)多次抽吸液體制成菌懸液，將菌懸液移至一次性無菌塑料試管中，置振蕩器上振蕩5 min，靜置10 min。用加樣槍吸取1 ml上層均質(zhì)液體至無菌試管中，調(diào)整菌懸液濃度為（2～3）×105CFU/ml，即比濁儀的濁度為0.2～0.3麥?zhǔn)蠁挝籟5]，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板驗(yàn)證計(jì)數(shù)。質(zhì)控菌株采用上述方法制備菌懸液。取部分已制備好的菌懸液20 μl，用滅菌蒸餾水稀釋25倍后取100 μl均勻涂布于SDA培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)3～5 d后，計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿上菌落的數(shù)量，以獲取準(zhǔn)確的菌懸液濃度。

1.2.2 96孔藥敏板的制備及培養(yǎng) 采用M38-A2方案[2]及文獻(xiàn)[3,4]推薦的微量液基稀釋法制備96孔藥敏板（圖1）。將4種藥物的儲(chǔ)備液取出融化后，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物濃度稀釋成藥敏板首孔終濃度的 2 倍，即 GRI 32 μg/ml，ICZ 32 μg/ml，TBF 1 μg/ml，F(xiàn)CZ 128 μg/ml。用 96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先在1～11孔中各加入100 μl RPMI 1640培養(yǎng)基，第12孔加200 μl RPMI 1640培養(yǎng)基；以GRI為例，在首孔內(nèi)加入32 μg/ml 的工作液100 μl，混勻，此時(shí)首孔藥物濃度為16 μg/ml，從中吸取100 μl加入第2孔，混勻后第2孔的濃度為8 μg/ml，以此類推稀釋至第10孔時(shí)，將最后的100 μl液體棄去。第11孔為生長對(duì)照（陽性對(duì)照），不加藥物稀釋液，第12孔為空白對(duì)照（陰性對(duì)照）。在第1～11孔中各加入100 μl菌懸液，此時(shí)1～12孔內(nèi)均含有200 μl的液體。將已接種完成的96孔藥敏板放置28℃恒溫箱中靜置孵育培養(yǎng)，96 h后讀取最低抑菌濃度（MIC）值。每次試驗(yàn)均包括質(zhì)控菌株。

1.2.3 微量稀釋法MIC值判讀 根據(jù)CLSI M38-A2方案的標(biāo)準(zhǔn)，在自然光充足的條件下，借助閱讀鏡輔助肉眼判讀MIC值。將加有GRI、ICZ、TBF、FCZ的孔中菌落生長情況與生長對(duì)照相比，肉眼觀察出現(xiàn)80%或更多生長抑制作為判讀MIC值的標(biāo)準(zhǔn)。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由2人共同判讀MIC值。每株標(biāo)本重復(fù)做2次實(shí)驗(yàn)。

圖1 倍比稀釋法制備96孔藥敏板制備圖

1.2.4 質(zhì)控 實(shí)驗(yàn)過程中盡量排除可能影響實(shí)驗(yàn)的因素，比如新配制的RPMI 1640培養(yǎng)基、抗真菌藥物的批號(hào)更換、新制備的96孔藥敏板以及實(shí)驗(yàn)器皿的更換等，均應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制，以確保體外抗真菌藥敏試驗(yàn)過程的精確性和準(zhǔn)確性，嚴(yán)格監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中的溫度、濕度及儀器的使用狀況，操作時(shí)嚴(yán)格按操作要求進(jìn)行。每次操作過程均設(shè)質(zhì)控菌株。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，抗真菌藥物之間的MIC值進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，不同菌種的兩兩比較采用S-N-K法。P＜0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過96 h培養(yǎng)后觀察，GRI、ICZ、TBF、FCZ 4 種藥物敏感試驗(yàn)的MIC范圍見表1，MIC50值及MIC90值見表2。4種抗真菌藥物對(duì)犬小孢子菌的藥敏試驗(yàn)MIC90：GRI為2.000 0 μg/ml，ICZ 為 0.500 0 μg/ml，TBF 為 0.015 6 μg/ml，F(xiàn)CZ 為16.000 0 μg/ml。4種抗真菌藥物對(duì)須癬毛癬菌復(fù)合體的藥敏試驗(yàn) MIC90：GRI為 1.000 0 μg/ml，ICZ 為0.500 0 μg/ml，TBF 為 0.062 5 μg/ml，F(xiàn)CZ 為 32.000 0 μg/ml。4種抗真菌藥物對(duì)石膏樣小孢子菌的藥敏試驗(yàn)MIC90：GRI 為 2.000 0 μg/ml，ICZ 為 1.000 0 μg/ml，TBF 為 0.062 5 μg/ml，F(xiàn)CZ 為 16.000 0 μg/ml。

4種不同抗真菌藥物對(duì)犬小孢子菌、須癬毛癬菌復(fù)合體和石膏樣小孢子菌的MIC值經(jīng)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。采用S-N-K法對(duì)不同菌種兩兩比較可知，4種藥物對(duì)犬小孢子菌和須癬毛癬菌復(fù)合體的藥敏試驗(yàn) MIC 值平均秩次為：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ，4種藥物對(duì)石膏樣小孢子菌的藥敏試驗(yàn)MIC值平均秩次為 ：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以 3 種皮膚癬菌為總體進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)和S-N-K法檢驗(yàn)，4種藥物對(duì)皮膚癬菌的MIC值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其藥敏試驗(yàn)MIC值的平均秩次為：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。

3 討論

2008年美國CLSI在產(chǎn)孢絲狀真菌M38-A藥敏試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)上提出了M38-A2方案[2]，試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化使皮膚癬菌抗真菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表1 皮膚癬菌的MIC值 （μg/ml）

表2 皮膚癬菌的MIC50值及MIC90值 （μg/ml）

菌 株 GRI ICZ TBF FCZ P值M. canis 51.79 33.93 11.10 73.19 0.000 T. mentagrophytes 14.17 10.33 4.00 21.50 0.000 N. gypsea 10.40 10.30 3.60 17.70 0.002 Tot 75.28 54.13 17.27 111.39 0.000

GRI在1958年開始用于臨床，應(yīng)用時(shí)間長，是20世紀(jì)末治療頭癬的主要用藥。隨著科學(xué)的發(fā)展，ICZ和TBF已成為目前治療皮膚癬菌病最常用的口服抗真菌藥。本實(shí)驗(yàn)對(duì)GRI、ICZ、TBF和FCZ 4種藥物的MIC值比較顯示，4種不同抗真菌藥物對(duì)犬小孢子菌、須癬毛癬菌復(fù)合體和石膏樣小孢子菌的MIC值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種藥物對(duì)犬小孢子菌和須癬毛癬菌復(fù)合體的抗真菌效果依次為TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ；4種藥物對(duì)石膏樣小孢子菌的抗真菌效果依次為：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以3種皮膚癬菌為總體分析可見，4種藥物對(duì)皮膚癬菌的抗真菌效果依次為 TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。以特比萘芬的抗真菌效果最好，MIC90為0.0625 μg/ml，MIC值范圍為 0.001 0 ～ 0.062 5 μg/ml，其次為 ICZ 和 GRI，F(xiàn)CZ的抗真菌效果較差，與Silvat等[6]和Ansari 等[7]報(bào)道的結(jié)果基本相同。實(shí)驗(yàn)證明，早期正確的抗真菌治療直接影響患者的預(yù)后[8]，該結(jié)果可對(duì)本地區(qū)皮膚癬菌病患者的臨床治療提供選藥參考。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ansari等[7]進(jìn)行的一項(xiàng)研究結(jié)果不完全一致，可能是由于菌種的地區(qū)差異，對(duì)抗真菌藥物的敏感性不同，或?qū)嶒?yàn)室間方法及操作差異的結(jié)果。本試驗(yàn)缺乏皮膚癬菌抗真菌藥物的體內(nèi)試驗(yàn)及對(duì)MIC值與臨床患者治療效果之間的相關(guān)性分析，有待進(jìn)一步研究。

Gupta等[9]提出了關(guān)于現(xiàn)有藥物的新配方及藥物創(chuàng)新的見解。Lopes等[10]介紹了各種植物衍生物及其活性成分抗皮膚癬菌的作用機(jī)制。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，生物堿類、酚類、黃酮類中藥單體具有抗真菌活性，且與目前臨床應(yīng)用的抗真菌藥物有協(xié)同作用[11]。人口的流動(dòng)、人類生活方式的改變及抗真菌藥物的應(yīng)用不斷推動(dòng)著皮膚癬菌的進(jìn)化[12]，是否可以找到尚未開發(fā)的化學(xué)成分的新藥是目前面臨的問題。