何春鋒，張青川，劉 永

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院泌尿外科，上海 200062；

2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200080

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。移行細(xì)胞癌占90%以上，具有多發(fā)性和易復(fù)發(fā)等特點。新發(fā)膀胱癌70%～80%為淺表性膀胱癌，其中10%～15%不可避免地發(fā)展為浸潤性膀胱癌。研究表明，p53和PTEN基因缺失或突變導(dǎo)致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的紊亂［1-2］，從而引起淺表性膀胱癌的發(fā)生和促進(jìn)原位癌的浸潤及轉(zhuǎn)移。mTOR信號通路被認(rèn)為是一個調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長的信號匯聚點。mTOR在腫瘤細(xì)胞生存、生長、蛋白合成、細(xì)胞代謝及血管生成等方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。mTOR存在形式主要有2種：mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTOR complex 2，mTORC2）。藥物雷帕霉素可阻斷mTORC1，從而抑制腫瘤的生長，但其效果仍不滿意。mTORC2的發(fā)現(xiàn)晚于mTORC1，兩者共同含有哺乳動物酵母同源致命因子Sec13蛋白8（mammalian lethal with SEC13 protein 8，mLST8）和mTOR。mTORC2對雷帕霉素不敏感。mTORC2功能的發(fā)揮離不開其必需成員之一的rictor。抑制rictor的表達(dá)，從而可間接抑制mTORC2功能的發(fā)揮［3-5］。由于rictor的發(fā)現(xiàn)較晚，因而對mTORC2的結(jié)構(gòu)和功能仍在進(jìn)一步的研究中。Sarbassov等［6］發(fā)現(xiàn)，mTORC2復(fù)合物能夠磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）分子中一系列的氨基酸殘基，進(jìn)而激活A(yù)KT。AKT在細(xì)胞分化和存活過程中扮演重要角色，許多惡性腫瘤細(xì)胞中AKT的活性都有異常升高。在體外實驗中，mTOR與rictor結(jié)合后能直接磷酸化AKT的Ser473位點，與重組人丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）一起完成對AKT的激活［6］。如果能找到一種分子來阻斷腫瘤細(xì)胞中mTORC2的形成，則能夠抑制AKT的激活，并阻止腫瘤的進(jìn)一步形成和生長，這可能是今后腫瘤治療的新途徑。本研究以人膀胱癌細(xì)胞株T24為研究對象，采用siRNA技術(shù)抑制rictor基因表達(dá)，從而抑制mTORC2的功能，進(jìn)而觀察其對膀胱癌T24細(xì)胞在體內(nèi)外生長的影響，進(jìn)一步揭示rictor在膀胱癌進(jìn)程中的作用，旨在為治療膀胱癌尋找一種新的策略。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒

人膀胱癌T24細(xì)胞株(p53缺失，G3)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。細(xì)胞株按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。質(zhì)粒載體pGCSIL-PUR購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。載體pGCSIL-PUR含嘌呤霉素的耐藥基因，可在嘌呤霉素作用下篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。大腸桿菌DH5α由復(fù)旦大學(xué)遺傳所贈送。

1.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

Rictor基因按照RNA干擾（RNA interference，RNAi）的條件設(shè)計三對干擾不同基因位點的RNA片段，分別取名為1#、2#和3#，GC%均為42.10%，該工作由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成。siRNA靶序列如下：1#為CAGACATAGTCCAGATACA，2#為GCCAAGTC CTTCAACATAA，3#為GCAGCCTTGAAC TGTTTAA。將目的片段插入到用AgeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切處理過的線性載體pGCSIL-PUR中獲得重組載體。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取陽性克隆，酶切鑒定。

1.3 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染

將膀胱癌細(xì)胞株T24接種于24孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)使細(xì)胞密度達(dá)90%～95%。分別取1#、2#、3#和陰性對照（negative control，NC）質(zhì)粒按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。檢測各轉(zhuǎn)染組RNA表達(dá)差異需繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h，檢測各轉(zhuǎn)染組rictor蛋白的表達(dá)差異需繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.4 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及單克隆的擴增，穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

將上述檢測最有效干擾2#質(zhì)粒與NC質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入膀胱癌T24細(xì)胞株中，并分別命名為RNAi組和NC組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為空白組。進(jìn)而采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）篩選出干擾效果明顯的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.5 RTFQ-PCR和Western blot檢測RNAi后rictor的表達(dá)

RTFQ-PCR按照TRIZOL試劑盒說明書進(jìn)行。用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，然后采用Western blot檢測細(xì)胞中rictor蛋白的表達(dá)情況。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。Rictor基因定量PCR引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。上游引物：5’-AATTGGAAAAGTGGCACAGG-3’；下游引物：5’-GGCAGCCTGTTTTATGGTGT-3’。

1.6 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）實驗檢測細(xì)胞增殖

取96孔板按照實驗分組培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞分為空白組(T24)、NC組、2#-1組和2#-2組。每組設(shè)6個平行樣本，結(jié)果取平均值。取細(xì)胞貼壁后0、24、48和72 h等時間點檢測吸光度（D）值。置酶標(biāo)儀上測各孔D值，空白對照孔調(diào)零，濾過波長為450 nm。以下列公式計算抑制率：抑制率（CI，%）=（對照組D值－實驗組D值）/對照組D值×100%。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗

細(xì)胞劃痕實驗是指將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上，待細(xì)胞融合后用細(xì)胞刮在中央?yún)^(qū)域畫一條線，這條線內(nèi)的細(xì)胞被機械力去除掉，然后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞向無細(xì)胞的劃痕區(qū)域遷移的情況，來判斷細(xì)胞的遷移能力。刮細(xì)胞的過程要注意保持無菌操作。

1.8 細(xì)胞周期分析及細(xì)胞存活率分析

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL。實驗分為T24組、NC組、2#-1組和2#-2組。將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)。在細(xì)胞匯合度約70%時處理細(xì)胞。按規(guī)定設(shè)置好儀器各參數(shù)，用流式細(xì)胞儀自帶cell cycle檢測軟件檢測細(xì)胞周期，用流式細(xì)胞儀自帶cell death檢測軟件檢測細(xì)胞的存活率，并用其自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 裸鼠皮下移植瘤生長情況

BALB/c裸小鼠（均為雌鼠）分為4組（T24組、NC組、2#-1組和2#-2組），每組8只，分別接種4種細(xì)胞，每只裸鼠于一側(cè)臀部接種5×106個細(xì)胞，觀察裸鼠皮下腫瘤生長情況，接種后第10天開始測量，每3天測量1次瘤體長短徑，并根據(jù)公式V=1/2ab2（V為體積，a為長徑，b為短徑）計算腫瘤體積。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體

將篩選獲得的克隆送上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析證實已將針對rictor基因序列設(shè)計的3條寡核苷酸雙鏈克隆入pGCSIL-PUR真核表達(dá)載體（圖1）。

圖 1 3種質(zhì)粒測序圖Fig. 1 Sequencing map of 3 plasmids

2.2 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染篩選最有效干擾質(zhì)粒2#

分別取1#、2#、3#和NC質(zhì)粒各0.4 μg，分別加入無血清及無抗生素的OPTI-MEM培養(yǎng)液25 μL。取LipofectamineTM2000 0.7 μL各加入無血清及無抗生素的OPTI-MEM培養(yǎng)液100 μL，溫育5 min。將上述質(zhì)粒分別與LipofectamineTM2000小心混勻，室溫靜置20 min，形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物各50 μL。將上述重組質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物50 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。檢測各轉(zhuǎn)染組rictor蛋白的表達(dá)差異。1#組、2#組和3#組rictor蛋白表達(dá)水平均降低，分別降低(28.36±5.40)%、(90.30±5.23)%和(64.90±2.74)%，與NC組和空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2），其中2#的抑制最為明顯。

圖 2 Rictor-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞rictor蛋白表達(dá)Fig. 2 Protein expression of rictor after transient transfection

2.3 篩選出最有效干擾質(zhì)粒穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選2#-1及2#-2

將2#質(zhì)粒與NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入膀胱癌T24細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。1∶10傳代，接著換含600 ng/μL嘌呤霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選20 d左右，空白組細(xì)胞全部死亡，RNAi組和NC組均有細(xì)胞克隆形成。當(dāng)細(xì)胞克隆長至直徑約0.5 cm時，挑取單細(xì)胞陽性克隆繼續(xù)在含600 ng/mL嘌呤霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。

2.3.1 Western blot 檢測rictor蛋白水平

將2#質(zhì)粒進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染，篩選了兩株單克隆細(xì)胞，分別命名為2#-1組和2#-2組。Western blot結(jié)果顯示，2#-1組和2#-2組rictor蛋白水平均降低，分別降低（95.71±2.40）%和（78.89±4.80）%，與NC組和空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中2＃-1穩(wěn)定株的抑制最為明顯，其次為2#-2穩(wěn)定株（圖3）。

2.3.2 RTFQ-PCR檢測rictor mRNA表達(dá)

對所采集的各數(shù)據(jù)以空白組為參照，用2-△△Ct的方法進(jìn)行相對定量分析，2#-1組和2#-2組rictor mRNA表達(dá)量分別為0.103±0.035和0.287±0.030，與NC組和空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC組和空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖 3 Rictor-siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)后各組細(xì)胞rictor蛋白水平Fig. 3 Protein level of rictor after stable transfection

圖 4 Rictor-siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)后各組細(xì)胞rictor的mRNA表達(dá)Fig. 4 The mRNA expression of rictor after transient transfection

2.4 沉默rictor基因顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞株的體外增殖

將4組細(xì)胞分別接種于4塊96空板中，每孔加入100 μL 3 000個細(xì)胞。每個固定時間點檢測1塊96空板。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長時測定D值。2#-1細(xì)胞株體外增殖最慢，2#-2次之，空白組(T24)和NC組無顯著差異（圖5）。觀察發(fā)現(xiàn)在48 h時細(xì)胞抑制率最高，2#-1和2#-2抑制率分別達(dá)到（42.68±4.57）%和（33.94±2.06）%。由此可見，沉默rictor基因表達(dá)能顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞株的體外增殖。

圖 5 Rictor-RNAi對T24細(xì)胞株體外增殖的影響Fig. 5 The effects of rictor-RNAi on cell proliferation in T24 cell lines

2.5 沉默rictor基因表達(dá)顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞株的遷移能力

在6孔板每孔中加入約5×105個細(xì)胞，過夜能鋪滿。第2天用移液器吸嘴比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按0、12和24 h取樣，在倒置顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)細(xì)胞。4組比較，空白組和NC組24 h時可見刮痕內(nèi)細(xì)胞已與周邊基本融合，刮痕邊界消失；而2#-1組和2#-2組仍可見清晰刮痕（兩者相比，2#-2組遷移較快），說明rictor-RNAi可明顯抑制T24細(xì)胞的遷移率。不同時間點所拍攝細(xì)胞遷移圖片見圖6。

圖 6 Rictor-RNAi對細(xì)胞遷移的影響Fig. 6 The effect of cell migration after rictor-RNAi

2.6 沉默rictor基因表達(dá)有效阻滯膀胱癌T24細(xì)胞株細(xì)胞周期的進(jìn)展

實驗分為空白組、NC組、2#-1組和2#-2組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞密度為1×105個/mL懸液。將細(xì)胞接種于6空板中，在細(xì)胞匯合度約70%時收集細(xì)胞并處理。按規(guī)定設(shè)置好儀器各參數(shù)，用流式細(xì)胞儀自帶Cell circle檢測軟件檢測細(xì)胞周期，并用其自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Rictor-RNAi可抑制mTORC2功能的發(fā)揮，使靶細(xì)胞停滯于G1期，最高達(dá)(62.22±4.22）%。與空白組和NC組相比，2#-1組和2#-2組G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05，圖7，表1），提示rictor-RNAi能有效阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而抑制細(xì)胞增殖。

圖 7 Rictor-RNAi對T24細(xì)胞周期的影響Fig. 7 The effect of rictor-RNAi on cell cycle in T24 cells

表 1 Rictor-RNAi對T24細(xì)胞G1期的影響Tab. 1 The effect of rictor-RNAi on G1 phase in T24 cells

2.7 沉默rictor基因表達(dá)顯著提高膀胱癌T24細(xì)胞死亡率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL。實驗分為空白組、NC組、2#-1組和2#-2組。將細(xì)胞接種于6空板中培養(yǎng)。在細(xì)胞匯合度約70%時收集并處理細(xì)胞。按規(guī)定設(shè)置好儀器各參數(shù)，用流式細(xì)胞儀自帶Cell Death檢測軟件檢測細(xì)胞的存活率，并用其自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Rictor-RNAi單獨作用可明顯抑制細(xì)胞存活，細(xì)胞死亡率最高達(dá)（21.42±3.60）%，較空白組（9.85±2.50）%及NC組（9.78±3.45）%明顯升高（P＜0.05，圖8，表2）。提示沉默rictor基因表達(dá)顯著提高膀胱癌T24細(xì)胞死亡率。

2.8 沉默rictor基因表達(dá)顯著減緩裸鼠皮下移植瘤生長速率

裸小鼠皮下移植瘤生長31 d時，移植瘤的平均體積，2#-1組[（200±10.99）mm3]和2#-2組[（294.71±33.43）mm3]明顯低于空白組[（1 3 8 6.7 6±9 8.8 0）m m3]和N C組[（1 375.00±100.04）mm3]，2#-1組和2#-2組與空白組和NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而空白組與NC組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖9～10），說明所用質(zhì)粒在體內(nèi)亦沒有明顯影響細(xì)胞的生長。實驗證明沉默rictor基因表達(dá)能夠顯著減緩裸鼠皮下移植瘤生長。

圖 8 Rictor-RNAi對T24細(xì)胞死亡的影響Fig. 8 The effect of rictor-RNAi on cell death in T24 cells

表 2 rictor-RNAi對T24細(xì)胞死亡的影響Tab. 2 The effect of rictor-RNAi on cell death in T24 cells

圖 9 裸鼠皮下移植瘤生長曲線Fig. 9 The growth curve of subcutaneous xenograft tumor in nude mice

3 討 論

雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，T O R）屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶（phosphoinositide kinase-related kinase，PIKK）超家族，作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶發(fā)揮作用，首先在酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)其同源物，即mTOR。mTOR信號通路控制細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯，參與膜蛋白轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)降解、蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和核糖體合成等一系列生理病理過程［7-9］。mTOR形成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物發(fā)揮生理病理作用。mTORC2包含mLST8、mTOR、rictor蛋白等［10-11］。其中rictor為mTORC2行使功能所必需的分子。因FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物不能夠結(jié)合在mTORC2上，mTORC2對雷帕霉素的治療不敏感［12-13］。目前研究表明，mTORC2參與細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)造［14-15］、維持細(xì)胞生存及參與細(xì)胞代謝等。目前僅能推測調(diào)節(jié)mTORC1的因素，如生長因子和營養(yǎng)水平，并不影響mTORC2的活性。mTOR復(fù)合物的總量保持相對穩(wěn)定，提示二者之間可能存在某種相互制約的關(guān)系［6］。對mTORC2功能的研究有助于進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)病機制，從而有助于設(shè)計新的治療這些疾病的藥物。

圖 10 裸鼠皮下移植瘤實驗瘤體圖Fig. 10 The tumor diagram of subcutaneous xenograft tumor in nude mice

本研究以人膀胱癌T24細(xì)胞株為研究對象，采用siNRA技術(shù)抑制rictor基因表達(dá)，可間接抑制mTORC2功能的發(fā)揮，從而觀察其對膀胱癌T24細(xì)胞在體內(nèi)外生長的影響。本研究顯示，RNAi組細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移明顯減慢，rictor基因表達(dá)抑制比例增加，其細(xì)胞增殖和遷移減慢比例亦增加。同時RNAi組G1期細(xì)胞比例增加，RNAi后死亡細(xì)胞比明顯增加，約21.42%。裸鼠皮下移植瘤生長實驗示接種31 d時，移植瘤的平均體積，2#-1組和2#-2組明顯低于空白組和NC組。

綜上所述，rictor-RNAi沉默膀胱癌細(xì)胞rictor基因的表達(dá)能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞死亡，并使細(xì)胞停滯在G1期，并能有效地抑制裸鼠移植瘤的生長，這為膀胱癌的基因治療或藥物治療提供了一定的實驗依據(jù)，同時為以mTORC2為靶標(biāo)治療膀胱癌的策略提供了新思路。