張 敏，王琳娜，孫 超

1.濟(jì)南市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 271100；

2.山東省青島療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266071；

3.青島市市立醫(yī)院高壓氧科，山東 青島 266071

胰腺導(dǎo)管癌是一種惡性程度很高的消化道惡性腫瘤，5年生存率不足8%［1］。90%的胰腺癌為起源于胰腺管上皮的導(dǎo)管腺癌，侵襲性強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移，早期確診率低，手術(shù)死亡率高，治愈率低，是預(yù)后極差的惡性腫瘤之一［2］。胰腺導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。腫瘤細(xì)胞的增殖依賴于有氧糖酵解；葡萄糖的有氧糖酵解產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致酸性的腫瘤微環(huán)境［3］。研究發(fā)現(xiàn)，酸性的腫瘤微環(huán)境有助于腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)［4］。由此可見(jiàn)，乳酸代謝在腫瘤中起著重要作用［5］。因此，研究胰腺導(dǎo)管癌中的乳酸代謝有著重要意義。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(monocarboxylate transporter 1，MCT1）是一種跨膜蛋白，幾乎存在于所有腫瘤細(xì)胞中，主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)酮體、乳酸及丙酮酸等［3］。在腫瘤細(xì)胞中，有氧糖酵解是主要的代謝方式［6］，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的乳酸增多，需要依賴于MCT1及時(shí)將細(xì)胞內(nèi)的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，維持細(xì)胞內(nèi)的pH值不至于過(guò)低；同時(shí)，乳酸亦可以作為“替代燃料”，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖缺乏時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)利用乳酸作為能源，MCT1會(huì)將細(xì)胞外游離的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，以維持腫瘤細(xì)胞的能量需求［7］。因此，MCT1在乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝中起著重要作用。研究證實(shí)，MCT1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［8］，但MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中的作用仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。本研究擬從體內(nèi)胰腺導(dǎo)管癌臨床組織水平及體外細(xì)胞系水平探討MCT1在胰腺導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義及在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系遷移浸潤(rùn)中的作用。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

從濟(jì)南市人民醫(yī)院病理科調(diào)取2006—2010年手術(shù)切除的胰腺導(dǎo)管癌組織及癌旁正常組織樣本78對(duì)，組織均為術(shù)前病理冰凍診斷所取，未經(jīng)任何放化療。所有樣本均經(jīng)常規(guī)石蠟切片，H-E染色，并由高年資臨床病理科醫(yī)師檢查確診為胰腺導(dǎo)管癌。從濟(jì)南市人民醫(yī)院普外科收集51對(duì)新鮮液氮速凍的胰腺癌及癌旁正常組織標(biāo)本用于提取總RNA。本研究所調(diào)取的石蠟包埋樣本和液氮凍存的新鮮組織均得到濟(jì)南市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有樣本均由相應(yīng)的患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與miRNA轉(zhuǎn)染

胰腺癌細(xì)胞系PANC-1（人胰腺上皮樣癌細(xì)胞，超三倍體）和Capan-1（人胰腺上皮腫瘤細(xì)胞，攜帶BRCA2 6174位移碼突變）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。PANC-1和Capan-1接種到含10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。MCT1慢病毒干擾載體的MCT1干擾序列、對(duì)照序列及具體構(gòu)建方法主要參照參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。干擾序列及其對(duì)照序列主要由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。病毒轉(zhuǎn)染參照病毒載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。miR-124-3p mimic（5’-UAAGGCACG CGGUGAAUGCC-3’）、miR-124-3p inhibitor（5’-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3’）和陰性對(duì)照miR-124-3p-scramble（5’-ACUA CUGAGUGACAGUAGA-3’）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成用于轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞。miR-124-3p mimic、miR-124-3p inhibitor和陰性對(duì)照miR-124-3p-scramble轉(zhuǎn)染根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］進(jìn)行具體操作。

1.3 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)

運(yùn)用TRIzol（購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）法提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA用NCode? miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行mRNA或miRNA反轉(zhuǎn)錄成20 μL體系cDNA。使用SYBR Green Master mix（購(gòu)自日本Takara公司）和IQ5 RTFQ-PCR系統(tǒng)（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司）擴(kuò)增cDNA模板。檢測(cè)MCT1 mRNA以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測(cè)miR-124-3p則以U6作為內(nèi)參基因。miR-124-3p莖-環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物序列：5’-GCCTATGGCTTTTTATTCCTATGT-3’。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系按試劑盒說(shuō)明配制。miR-124-3p的正義鏈為5’-GCTAAGGCACGCGGTG-3’，反義鏈為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；MCT1的正義鏈為5’-AAGGCATCCAGACCAGA AACCG-3’，反義鏈為5’-AGCATCGAGCA G G G C T C TA A C C-3’；U 6的正義鏈為5’-G T G C T C G C T T C G G C A G C A C ATA TA C TA A A AT T G G A A-3’，反義鏈為5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG -3’，特異性反轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACAAAATA-3’；β-actin的正義鏈為5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’，反義鏈為5’-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3’。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min，95 ℃、30s，60 ℃、35 s，共40個(gè)循環(huán)，記錄循環(huán)閾值（Ct），采用2-△△Ct法計(jì)算miR-124-3p和MCT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 熒光素酶報(bào)告檢測(cè)

為了驗(yàn)證miR-124-3p能否結(jié)合MCT1 3’-UTR序列，我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)MCT1 3’-UTR序列，發(fā)現(xiàn)MCT1 3’-UTR序列上具有miR-124-3p的結(jié)合位點(diǎn)。我們自行構(gòu)建了在GV272載體上亞克隆包含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)或突變的3’-UTR的片段。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司DNA測(cè)序驗(yàn)證正確后，使用LipofectamineTM3000根據(jù)說(shuō)明書(shū)將該質(zhì)粒與miR-124-3p mimic或scramble序列共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

石蠟切片均應(yīng)放置到60 ℃恒溫箱中烘烤1 h；石蠟切片移入新鮮配制二甲苯溶液中浸泡20 min，更換二甲苯后再次浸泡20 min；切片分別置于梯度乙醇中進(jìn)行脫蠟處理；蒸餾水；3%H2O2浸泡切片10 min，盡可能滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS清洗后，進(jìn)行檸檬酸緩沖液抗原熱修復(fù)。滴加羊血清封閉液，室溫溫育1 h；棄去封閉液并直接滴加一抗（稀釋度1∶200，購(gòu)自美國(guó)Origene公司），切片置于免疫組織化學(xué)濕盒中，于4 ℃冰箱中溫育過(guò)夜；第2天，棄去一抗，PBS清洗3次，每次5 min；滴加相應(yīng)的二抗（鼠/兔通用型二抗，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫溫育1 h；PBS清洗3次，每次5 min；每張切片滴加1滴新鮮配制的DAB顯色液進(jìn)行顯色，當(dāng)肉眼可見(jiàn)切片組織呈棕色或顯微鏡觀察到組織經(jīng)DAB顯色后呈現(xiàn)出淺棕色著色時(shí)，應(yīng)注意及時(shí)終止顯色反應(yīng)；切片晾干后封片（中性樹(shù)膠），顯微鏡下逐一觀察切片染色效果，并使用Leica圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行病理組織圖像采集。

1.6 免疫組織化學(xué)定量評(píng)分

MCT1表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒。免疫組織化學(xué)染色后，每張病理切片均隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野，切片分別經(jīng)低、中、高倍鏡觀察分析，由2名高年資病理科醫(yī)師根據(jù)切片的染色強(qiáng)度及組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例定義為：＜5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。根據(jù)染色強(qiáng)度定義為：陰性（基本不著色），0分；弱陽(yáng)性（呈淺黃色），2分；中等陽(yáng)性（呈棕黃色），3分；強(qiáng)陽(yáng)性（呈棕褐色），4分。染色指數(shù)（staining index，SI）是綜合切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的染色強(qiáng)度及切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例，兩者的乘積為染色指數(shù)評(píng)定的最終得分（即SI=切片染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞所占比例）。SI評(píng)分結(jié)果（0、1、2、3、4、6、8、9、12、16分），0～4分被判定為低表達(dá)，6～12分被判定為高表達(dá)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）以裂解細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，用BCA（購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）法測(cè)定樣品蛋白的濃度，加入5×蛋白緩沖液，在100 ℃下煮沸5 min使蛋白變性；準(zhǔn)備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠，用于蛋白質(zhì)電泳，轉(zhuǎn)到硝酸纖維性素膜上（購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司），用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，膜洗滌3次后，滴加特異性MCT1抗體（稀釋度1∶800，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）和β-actin抗體（稀釋度1∶1 000，購(gòu)自美國(guó)R&D公司），在4 ℃的條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，用TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫培育1 h，再次洗膜，滴加ECL行膜的曝光反應(yīng)。使用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，比較蛋白質(zhì)的變化。

1.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，主要參照參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。將要接種的細(xì)胞懸液混勻，將細(xì)胞懸液緩慢地沿壁加入24孔板孔內(nèi)，梯度按照每孔400、200、100個(gè)細(xì)胞，靜止5 min，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d以上。計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)并拍照。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)主要參照參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。劃痕所需工具均用75%乙醇擦拭，并置于超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外照射10 min；用直尺和標(biāo)記筆在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板背面均勻劃線，所劃直線橫穿過(guò)孔，每孔劃3條直線；常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（細(xì)胞密度約3×105個(gè)/mL）上，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%后，用移液器吸嘴（10 μL吸嘴）沿著直尺并盡量垂直于培養(yǎng)板背面的橫線劃痕；用無(wú)菌PBS清洗去除劃下的細(xì)胞，并更換為不含雙抗和血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；劃痕后細(xì)胞靜置培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照取樣，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)分析使用Image J軟件對(duì)劃痕的修復(fù)情況進(jìn)行定量分析。

1.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力

胰酶消化細(xì)胞并用PBS清洗，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為13.5 cm），用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基吹打細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度約3×104個(gè)/mL）；小室上室接種細(xì)胞懸液（100 μL/室），小室下室接種無(wú)血清培養(yǎng)基（500 μL/室），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)48 h；取出Transwell 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去小室內(nèi)液體，上室用4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS清洗小室上室，用棉簽擦拭小室內(nèi)Matrigel和殘留的細(xì)胞，小室置于0.1%結(jié)晶紫染液中，染色15 min；蒸餾水充分清洗結(jié)晶紫染液，小室置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，用倒置相差顯微鏡觀察穿出的細(xì)胞并拍照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次；統(tǒng)計(jì)分析使用Image J軟件對(duì)小室穿出的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)在進(jìn)行比較之前，先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)分布檢驗(yàn)。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行檢驗(yàn)后，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，可先將數(shù)據(jù)進(jìn)行函數(shù)轉(zhuǎn)換，使其符合正態(tài)分布，隨后再對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的比較分析。數(shù)據(jù)的組間比較采用交叉表及χ2檢驗(yàn)分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Log-rank法對(duì)差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)顯著上調(diào)

為明確MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平，我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了78例胰腺導(dǎo)管癌及配對(duì)癌旁正常組織。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，MCT1陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，相比癌旁正常組織，MCT1顯著高表達(dá)；其表達(dá)強(qiáng)度從陰性表達(dá)（7例）、弱陽(yáng)性（15例）、中陽(yáng)性（26例）到強(qiáng)陽(yáng)性（30例）不等。將中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性歸為MCT1高表達(dá)（56例），弱陽(yáng)性及陰性表達(dá)歸為低表達(dá)（22例）（圖1）。MCT1在癌旁正常組織中鮮有陽(yáng)性表達(dá)（4例），大部分癌旁正常組織（74例）中免疫組織化學(xué)技術(shù)難以檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)。由此可見(jiàn)，MCT1在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示MCT1可能起著癌基因的作用。

圖 1 MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)顯著上調(diào)Fig. 1 MCT1 was observed to be significantly over-expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues

2.2 MCT1高表達(dá)與胰腺導(dǎo)管癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有顯著相關(guān)性

在明確MCT1在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)后，我們分析了其表達(dá)的臨床病理學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，MCT1高表達(dá)與胰腺導(dǎo)管癌的分化程度（P=0.001）、臨床分期（P=0.042）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.012）具有顯著相關(guān)性；而與其他臨床病理學(xué)參數(shù)，如性別、年齡、腫瘤大小等均無(wú)顯著相關(guān)性（表1）。此外，在我們收集的78例臨床組織樣本中，有8例無(wú)預(yù)后信息，其余均有生存預(yù)后信息。為明確MCT1表達(dá)的預(yù)后意義，我們運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析了MCT1低表達(dá)與高表達(dá)的預(yù)后差異。其中在56例MCT1高表達(dá)患者中，有3例總預(yù)后信息缺失；22例MCT1低表達(dá)患者中，有5例總預(yù)后信息缺失。Kaplan-Meier生存曲線顯示，MCT1低表達(dá)與高表達(dá)之間胰腺導(dǎo)管癌患者的總預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016，圖2），提示MCT1的表達(dá)強(qiáng)度可以作為胰腺導(dǎo)管癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

2.3 沉默MCT1能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為明確MCT1在體外胰腺癌細(xì)胞惡性行為中的生物學(xué)作用，我們?cè)隗w外細(xì)胞系水平采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別探討了MCT1在胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默MCT1能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖（圖3）。我們?cè)O(shè)置了3個(gè)接種細(xì)胞密度梯度，分別為100、200和400個(gè)細(xì)胞每孔。相比對(duì)照組［PANC-1細(xì)胞對(duì)照組為（61±7）個(gè)，Capan-1細(xì)胞對(duì)照組為（69±6）個(gè)］，MCT1沉默后PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞其克隆形成數(shù)分別下降至（22±3）和（28±5）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組［PANC-1細(xì)胞對(duì)照組中間劃痕面積為（99.875±3.228）mm2，Capan-1細(xì)胞對(duì)照組中間劃痕面積為（102.147±2.630）mm2］，MCT1沉默后PANC-1細(xì)胞及Capan-1細(xì)胞劃痕面積分別下降至（37.343±5.772）及（60.281±5.904）mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，相比對(duì)照組［PANC-1細(xì)胞對(duì)照組浸潤(rùn)細(xì)胞

數(shù)目為（81±4）個(gè)，Capan-1細(xì)胞對(duì)照組浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目為（43±3）個(gè)］，MCT1沉默后PANC-1細(xì)胞及Capan-1細(xì)胞穿透Transwell基質(zhì)膠后細(xì)胞數(shù)分別下降至（22±7）及（21±5）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 1 MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義分析Tab. 1 Clinicopathological analysis of MCT1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma

圖 2 MCT1表達(dá)與胰腺導(dǎo)管癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析Fig. 2 Prognostic analysis of MCT1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues

圖 3 MCT1促進(jìn)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲Fig. 3 MCT1 was able to promote the proliferation, migration and invasion of pancreatic ductal adenocarcinoma cells

2.4 miR-124-3p負(fù)調(diào)控MCT1蛋白表達(dá)

為探討MCT1的可能作用機(jī)制，首先我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)了MCT1 3’-UTR序列，發(fā)現(xiàn)其3’-UTR序列具有miR-124-3p的結(jié)合位點(diǎn)（圖4A），提示miR-124-3p可能是MCT1的一個(gè)潛在調(diào)控miRNA。其次為了驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，我們進(jìn)一步運(yùn)用熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)分析了miR-124-3p與MCT1 3’-UTR序列的結(jié)合性。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組熒光活性值（1.238±0.478），miR-124-3p與MCT1 3’-UTR共轉(zhuǎn)染組熒光活性值（0.498±0.102）顯著下降，由此推斷miR-124-3p能夠結(jié)合在MCT1 3’-UTR序列上（圖4B），這也說(shuō)明了我們前期生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的正確性，揭示miR-124-3p能夠調(diào)控MCT1的表達(dá)，但其調(diào)控的性質(zhì)不明確。我們進(jìn)一步運(yùn)用Western blot，發(fā)現(xiàn)miR-124-3p能夠負(fù)調(diào)控MCT1的表達(dá)，即上調(diào)miR-124-3p能夠顯著性抑制MCT1蛋白的表達(dá)；反之亦然（圖4C）。為了在體內(nèi)臨床組織水平上進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124-3p對(duì)MCT1的調(diào)控關(guān)系，我們運(yùn)用RTFQ-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了51對(duì)新鮮液氮凍存的胰腺癌組織及癌旁正常組織中MCT1和miR-124-3p mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比癌旁正常胰腺組織，miR-124-3p在胰腺癌組織中顯著低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；相比癌旁正常組織，MCT1 mRNA在胰腺癌組織中顯著高表達(dá)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；采用Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)方法，可以看到在胰腺癌組織中，MCT1和miR-124-3p mRNA的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（圖4D），提示miR-124-3p可以顯著性負(fù)調(diào)控MCT1的蛋白水平。

圖 4 miR-124-3p負(fù)調(diào)控MCT1蛋白表達(dá)Fig. 4 miR-124-3p was identified to negatively regulate MCT1 expression

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)MCT1在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，上調(diào)的MCT1與胰腺導(dǎo)管癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有顯著相關(guān)性。在體外細(xì)胞系水平上，沉默MCT1能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)果提示，MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中起著癌基因的作用［13］，可能是胰腺導(dǎo)管癌治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。

MCT作為一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在于多種腫瘤細(xì)胞中。主要參與乳酸及其他單羧酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是對(duì)乳酸具有較高的親和力［13］。MCT家族已發(fā)現(xiàn)有14個(gè)成員，分別命名為MCT1到MCT14，他們具有相似的生化特征及不同的組織分布，但均能跨越細(xì)胞膜快速轉(zhuǎn)運(yùn)H+/乳酸。在腫瘤組織中以MCT1和MCT4最為常見(jiàn)［3］，幾乎所有的腫瘤均含有這兩種蛋白。并且MCT1與MCT4均需要CD147的輔助才能起作用。因此，在本研究中我們主要關(guān)注MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義及在體外胰腺癌細(xì)胞中所介導(dǎo)的生物學(xué)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT1在胰腺導(dǎo)管癌組織中顯著高表達(dá)，這與De Oliveira等［14］在胃腸道間質(zhì)瘤中的報(bào)道是一致的，即MCT1在胃腸道間質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)與預(yù)后差具有顯著相關(guān)性。MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)與預(yù)后差有關(guān)，這與Simoes-Sousa等［15］在口腔癌中及Johnson等［16］在乳腺癌中的發(fā)現(xiàn)均相一致，即MCT1高表達(dá)與預(yù)后差具有顯著相關(guān)性。我們?cè)隗w外胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和Capan-1中發(fā)現(xiàn)，沉默MCT1表達(dá)能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；Payen等［17］的報(bào)道支持了我們的這一結(jié)果，提示MCT1是腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。亦有研究發(fā)現(xiàn)，MCT1與腫瘤化療耐藥相關(guān)［18］。本研究未能開(kāi)展有關(guān)MCT1表達(dá)與化療耐藥的實(shí)驗(yàn)，因此有關(guān)MCT1的表達(dá)與化療耐藥相關(guān)性仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，Jeon等［19］在肝癌細(xì)胞中深入分析了沉默MCT1后肝癌細(xì)胞在乳酸攝取、氧氣消耗及脂肪合成方面的變化，發(fā)現(xiàn)沉默MCT1能夠顯著降低肝癌細(xì)胞對(duì)乳酸的攝??；此外，線粒體氧化磷酸化、脂肪合成及細(xì)胞增殖等均受到顯著性抑制。本研究未能分析沉默MCT1后，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度、線粒體氧化磷酸化和脂肪合成的變化；只觀察到胰腺癌細(xì)胞增殖受到了顯著性抑制。在后續(xù)研究中，我們將分析檢測(cè)沉默MCT1后胰腺癌細(xì)胞內(nèi)乳酸的濃度變化及相關(guān)代謝通路的改變。

為了探討MCT1在胰腺癌中作用的相關(guān)機(jī)制，我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-124-3p可能是MCT1的一個(gè)負(fù)調(diào)控miRNA。隨后的雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-124-3p對(duì)MCT1 3’-UTR序列區(qū)域的結(jié)合，提示我們的假設(shè)是正確的。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT1是miR-124-3p的一個(gè)新的負(fù)向調(diào)控靶基因。為了明確miR-124-3p在胰腺癌組織中的表達(dá)水平，我們運(yùn)用RTFQ-PCR技術(shù)檢測(cè)了51對(duì)新鮮凍存的胰腺癌及配對(duì)癌旁正常組織中miR-124-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織，miR-124-3p在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，這與先前在胰腺癌中的報(bào)道［20-22］是一致的。miR-124-3p不僅在胰腺癌組織中顯著低表達(dá)，在肝癌中亦呈現(xiàn)低表達(dá)［23］，提示miR-124-3p在癌組織中可能起著類(lèi)似抑癌基因的作用。本研究并未探討miR-124-3p在胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中所發(fā)揮的作用。本研究的樣本例數(shù)有限，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證［24］；此外，本研究未能分析沉默MCT1后，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度的變化及線粒體氧化磷酸化的變化，這也是本研究的一大缺憾。考慮到MCT1需要CD147蛋白的輔助才能發(fā)揮功能［25］，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)探討CD147在胰腺癌細(xì)胞中的作用。

綜上所述，MCT1在胰腺導(dǎo)管癌中起著癌基因的作用，miR-124-3p能夠負(fù)調(diào)控MCT1的表達(dá)。