張 玲，周曉燕，陳 穎，張 皓，高麗麗，王 宇，稽慶海，平 波，朱曉麗

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來快速上升［1］。目前，甲狀腺細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查（fine-needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）以其微創(chuàng)、易行及準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，成為臨床上診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性最常用的方法，但仍有20%的病例無法明確診斷［2］。在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中，BRAF V600E突變是迄今報(bào)道最多的突變類型［3-5］。檢測B超引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺細(xì)胞中的BRAF V600E突變可輔助細(xì)胞學(xué)診斷，提高診斷的靈敏度和準(zhǔn)確率。突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）方法利用特異性引物和雙環(huán)探針技術(shù)，將BRAF V600E檢測靈敏度提高到1%的突變比例，大幅提高了檢出率。本研究使用該方法對甲狀腺穿刺細(xì)胞液進(jìn)行BRAF V600E突變檢測，以組織病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評估BRAF V600E檢測與細(xì)胞學(xué)診斷的靈敏度和特異度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

2016年6月—2017年4月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受B超引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC患者共563例，穿刺細(xì)胞液同時(shí)行細(xì)胞學(xué)診斷及BRAF V600E突變檢測。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

QIAamp DNA Mini Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司，人類BRAF V600E突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。Eppendorf 5810R低速離心機(jī)購自德國Eppendorf AG公司，Thermo-Shaker恒溫金屬浴購自美國Thermo Fisher Scientific公司，QIAcube核酸提取儀購自德國QIAGEN公司，Thermo NANOdrop2000核酸濃度測定儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）儀購自美國Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

穿刺細(xì)胞液用Eppendorf 5810R低速離心機(jī)4 000 r/min離心30 min，去上清液，吸取沉淀加入裂解液放入Thermo-Shaker恒溫金屬浴56 ℃消化過夜。用QIAcube核酸提取儀提取DNA，用Thermo NanoDrop2000核酸濃度測定儀進(jìn)行定量，并將濃度統(tǒng)一稀釋至2 ng/μL。

1.2.2 RTFQ-PCR檢測

按上機(jī)樣本數(shù)量配制RTFQ-PCR混合液，混勻后以每管35 μL分裝到8聯(lián)管中，將稀釋好的DNA每個(gè)樣本取5 μL加入反應(yīng)管?；靹蚝笠? 000 r/min離心15～20 s后放入ABI7500 RTFQPCR儀進(jìn)行RTFQ-PCR并采集熒光信號，生成熒光信號值。RTFQ-PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)（第一階段）；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)（第二階段）；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)（第三階段）。信號收集：第三階段60 ℃時(shí)收集突變FAM和內(nèi)控HEX（或VIC）信號，執(zhí)行RTFQ-PCR，保存文件。

1.2.3 BRAF V600E突變結(jié)果判讀

按管號順序依次選擇單一突變檢測反應(yīng)管進(jìn)行檢測分析。需要同時(shí)選擇陽性質(zhì)控品反應(yīng)孔、陰性對照孔和樣品反應(yīng)孔，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)Threshold至擴(kuò)增曲線升起的拐點(diǎn)處，得到突變FAM信號或內(nèi)控HEX（或VIC）信號的Ct值。確定試驗(yàn)是否成功可信：待測樣品的內(nèi)控HEX（或VIC）信號應(yīng)有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct值應(yīng)在13～21之間。若內(nèi)控Ct值＞21或HEX信號無明顯擴(kuò)增，說明加入的DNA含有RTFQ-PCR抑制劑或DNA加入數(shù)量不夠，需要重新提取DNA或增加DNA用量后再進(jìn)行試驗(yàn)；但若FAM信號有明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct值＜28，該樣本無需重復(fù)檢測，檢測結(jié)果為BRAF V600E突變陽性。若內(nèi)控Ct值＜13，說明加入的DNA過量，應(yīng)減少DNA加入量再進(jìn)行試驗(yàn)；但若FAM信號無明顯擴(kuò)增曲線或Ct值＞28，該樣本無需重復(fù)檢測，檢測結(jié)果為BRAF V600E突變陰性。質(zhì)控品的FAM信號Ct值一般＜20，但可能會由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動。若樣本的FAM信號Ct值≥28，則樣本為陰性（或低于試劑盒的檢測下限）；若樣本的FAM信號Ct值＜28，則樣本為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在563例進(jìn)行BRAF V600E突變檢測的患者中，男女比例為1.0∶3.7（120∶443），年齡1～79歲，平均年齡（45.0±0.9）歲（表1）。BRAF V600E檢測成功率為99.3%（559/563），4例檢測失敗，無法判斷結(jié)果（ARMS方法檢測無HEX峰升起，提示擴(kuò)增失?。珺RAF V600E的總體突變率為50%。將標(biāo)本按細(xì)胞學(xué)診斷分為6級，其中良性32例，未見腫瘤細(xì)胞182例，非典型病變42例，個(gè)別異型細(xì)胞9例，疑濾泡性腫瘤6例，PTC及疑PTC 292例。

表 1 甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC標(biāo)本中BRAF V600E突變檢出率、細(xì)胞量及DNA濃度Tab. 1 BRAF V600E mutation, cell number and DNA concentration in the FNAC samples of thyroid nodule

388例FNAC標(biāo)本做細(xì)胞量評估，樣本總體均數(shù)可信區(qū)間為95%，細(xì)胞量評估＞60個(gè)細(xì)胞的樣本提取的DNA濃度均值為（9.0±1.2）ng/μL，細(xì)胞量評估＜60個(gè)細(xì)胞的樣本提取的DNA濃度均值為（6.0±1.7）ng/μL，兩組平均濃度均小于10 ng/μL。成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

209例患者接受手術(shù)并有組織病理學(xué)診斷結(jié)果，將組織病理學(xué)診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，評估細(xì)胞學(xué)及BRAF V600E檢測的準(zhǔn)確率。細(xì)胞學(xué)診斷PTC的靈敏度為86.6%，特異度為100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為20.6%。BRAF V600E單獨(dú)診斷甲狀腺惡性腫瘤的靈敏度為78.2%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為13.7%。FNAC聯(lián)合BRAF V600E診斷PTC的靈敏度為92.1%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為30.4%（表2）。FNAC聯(lián)合BRAF V600E檢測的陽性檢出率高于單獨(dú)FNAC及單獨(dú)BRAF V600E檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

組織病理學(xué)診斷為PTC的患者中，有11例患者細(xì)胞學(xué)診斷未見腫瘤細(xì)胞，但BRAF V600E檢測陽性，其中9例為微小PTC，2例為PTC，4例細(xì)胞量評估＞60，4例細(xì)胞量評估＜60，3例不滿意。

表 2 細(xì)胞學(xué)診斷和BRAF V600E診斷與組織病理學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)的比對Tab. 2 Comparison of cytological diagnosis and BRAF V600E diagnosis with histopathologic diagnosis

3 討 論

PTC是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，約占甲狀腺惡性腫瘤的80%［6］，近年來發(fā)病率明顯增高。目前研究發(fā)現(xiàn)，在PTC中BRAF V600E突變是最常見的基因異常，突變率為45%～80%［7-8］。BRAF V600E突變后可持續(xù)性激活Ras基因/絲蘇氨酸蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶激酶/絲裂原活化蛋白激酶（Ras/serine/threonine-protein kinase/mitogenactivated protein kinase kinase/mitogen-activated protein kinase，Ras/Raf/MAPKK/MAPK）信號通路促使甲狀腺細(xì)胞增殖，使濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生惡變，并可促進(jìn)高分化乳頭狀癌細(xì)胞發(fā)展為低分化和未分化癌細(xì)胞［9］。

目前甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺的細(xì)胞學(xué)診斷是術(shù)前良惡性診斷的重要手段，但是約20%的甲狀腺FNAC標(biāo)本細(xì)胞學(xué)無法明確診斷［10-13］，其惡性風(fēng)險(xiǎn)度為1.7%～6.6%［14］，該組患者常需要再次穿刺或易漏檢。因此，有學(xué)者開始將分子檢測應(yīng)用于FNAC標(biāo)本，期望提高FNAC術(shù)前診斷的準(zhǔn)確率。本研究用ARMS方法檢測B超引導(dǎo)下甲狀腺FNAC組織中的BRAF V600E突變，檢測成功率高達(dá)99.3%，方法簡便快速，適用于臨床術(shù)前輔助診斷。本研究中，評估比較細(xì)胞量＞60和＜60個(gè)細(xì)胞的兩組FNAC標(biāo)本的DNA提取濃度，均低于10 ng/μL，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞量的多少未影響DNA提取的濃度，可能由于細(xì)胞學(xué)評估并不能完全反映穿刺液中的實(shí)際細(xì)胞量。分析4例BRAF V600E突變檢測失敗的病例，細(xì)胞量的多少和DNA濃度的高低與檢測是否成功并不相關(guān)，推測導(dǎo)致ARMS方法檢測失敗的因素可能有DNA質(zhì)量差和殘留的熒光抑制劑等。本研究中，甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)診斷的靈敏度為86.6%，將細(xì)胞學(xué)診斷與BRAF V600E檢測結(jié)果相結(jié)合，靈敏度提高到92.1%，說明細(xì)胞學(xué)診斷聯(lián)合BRAF V600E檢測的準(zhǔn)確率優(yōu)于單獨(dú)細(xì)胞學(xué)診斷或單獨(dú)BRAF V600E檢測。分析11例組織病理學(xué)診斷及BRAF V600E檢測陽性、細(xì)胞學(xué)診斷陰性的病例，其中9例術(shù)后診斷為微小PTC，說明在微小PTC中，可能穿刺所得腫瘤細(xì)胞量較少，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷時(shí)易發(fā)生漏檢，而分子檢測BRAF V600E突變是將DNA呈指數(shù)級放大，檢測靈敏度更高，因此對于微小PTC，BRAF V600E突變與細(xì)胞學(xué)檢測二者結(jié)合可明顯提高診斷準(zhǔn)確率，降低漏檢率。

綜上所述，術(shù)前甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC標(biāo)本中用ARMS方法檢測BRAF V600E成功率高，是臨床上簡單易行的方法，細(xì)胞學(xué)診斷與BRAF V600E同時(shí)檢測，可提高甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC的術(shù)前診斷準(zhǔn)確率。