丁子桐，熊海霞，高琴琴，靖衛(wèi)霞，袁 芳，侯秀娟，朱躍蘭，孫文燕*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488； 2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，常表現(xiàn)為持久反復(fù)的關(guān)節(jié)滑膜炎癥，導致軟骨及骨質(zhì)破壞，最終造成關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[1]。該病在世界范圍普遍存在，嚴重危害人們的健康，而女性的發(fā)病率約為男性的2.5倍。RA的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，目前尚無根治藥物。大量研究證實，RA是一種主要由細胞因子參與介導的慢性炎性疾病。以炎性細胞因子為靶標的生物治療方法已成為RA研究中的熱點。RA屬中醫(yī)“痹證”范疇。痹證病因多為風、寒、濕、熱之邪外襲，以致諸邪夾雜痹阻為患[2]，寒濕痹、濕熱痹是其主要證候類型?？贵w芯片技術(shù)是通過陣列上的抗體識別樣品中的蛋白和其他分子，可以在微小樣品中篩查多項指標，具有高度特異性及多樣本平行性檢測等優(yōu)勢，在疾病診斷和個性化醫(yī)療方面已成為可靠的研究手段[3]。本研究應(yīng)用微陣列抗體芯片檢測RA大鼠、寒濕痹大鼠及濕熱痹大鼠血清相關(guān)炎性細胞因子，分析其細胞因子表達譜的差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠60只，體重160～180 g，左右，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境內(nèi)[SYXK(京)2016-0038]，溫度21℃～23℃，濕度60%～70%。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex公司，批號130435；弗氏完全佐劑(CFA)，美國Sigma公司，批號SLBD8147 V；大鼠RayBio AAR-CYT-G2炎癥因子抗體芯片，美國RayBiotech公司。

SHH-500ZSD動物實驗箱，重慶市永生實驗儀器廠；S10手提式高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Labofuge 400R低溫離心機，德國Heraeus公司；電子分析天平，美國Ohaus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RA病/證模型的復(fù)制

動物隨機分為4組，即正常組、RA組、寒濕痹組、濕熱痹組，每組15只。將牛Ⅱ型膠原(type II collagen, CⅡ)與等體積的弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)充分乳化，制成含CⅡ 1 mg/mL 的乳劑。除正常組外，各組大鼠在無菌條件下，每只左后足底皮內(nèi)注射100 μL乳劑，7 d后以同種乳劑尾根部100 μL再次免疫，正常組注射生理鹽水。

首次免疫第二天，將寒濕痹組和濕熱痹組大鼠置于動物實驗箱中。其中寒濕痹組設(shè)定溫度5℃，濕度95%，模擬寒濕外邪；濕熱痹組設(shè)定溫度35℃，濕度80%，模擬濕熱外邪。兩組均每天刺激4～6 h，連續(xù)42 d。

首次免疫后16 d，除正常組外，各組大鼠進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評分：0分，正常；1分，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；2分，踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和和輕微腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分，踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹[4]。每鼠最大評分16分，大于4分者為模型復(fù)制成功。RA組造模成功率約80%，寒濕痹組約73%，濕熱痹組約67%。各組造模成功率及AI評分均未見統(tǒng)計學差異。

1.3.2 微陣列抗體芯片檢測血清細胞因子表達譜

正常組大鼠及造模后大鼠于首次免疫后第44天，禁食不禁水12 h，腹主動脈采血，3500 r/min 離心10 min，分離血清。每只大鼠取血清50 μL，組內(nèi)混勻，應(yīng)用RayBio大鼠炎癥細胞因子抗體芯片檢測34個細胞因子，主要步驟：①封閉和孵育：將抗體芯片放入試劑盒提供的反應(yīng)盒中，在每個芯片孔中加入100 μL的1×封閉液，室溫孵育30 min。去除封閉緩沖液，每個孔中加入相應(yīng)的樣品100 μL，4℃過夜孵育；去除過量的樣品溶液，用不同的洗膜液分別洗玻片。將生物素標記抗體加入相應(yīng)孔內(nèi)，每孔70 μL，室溫孵育2 h，重復(fù)洗膜。每孔加入70 μL的1500倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，室溫孵育2 h，重復(fù)洗膜。②熒光檢測：待玻璃芯片完全晾干后用激光掃描儀進行掃描，圖像以圖片文件保存，熒光信號數(shù)據(jù)儲存為Microsoft Excel 文件。芯片膜上細胞因子名稱及位置見表1。將各點測得的原始灰度值除以芯片中的6個陽性對照點平均值，得出標準化后的灰度值，各組間比較，得出表達升高或降低倍數(shù)，比值小于0.66或大于1.5者認為有明顯差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

造模成功率及AI評分采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布則選用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者用LSD檢驗；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差不齊者選用兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生物學表征觀察

正常組大鼠后足踝呈現(xiàn)正常的粉紅色，無腫脹，行動自如，舌、耳、尾、爪色澤正常，而單純RA組大鼠則主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫，活動受限。除關(guān)節(jié)腫脹、行走不便外，寒濕痹組大鼠同時有畏寒喜暖，蜷縮少動，大便稀溏，舌、耳、尾、爪黯淡等表現(xiàn)，與中醫(yī)寒濕痹臨床癥狀相似；濕熱痹組大鼠出現(xiàn)躁動，大便粘滯，舌、耳、尾、爪發(fā)紅等表現(xiàn)，與中醫(yī)濕濕熱痹臨床癥狀相似。

2.2 RA病/證大鼠血清細胞因子表達譜

2.2.1 RA病/證大鼠與正常組大鼠比較

微陣列抗體芯片掃描結(jié)果見圖1。

由表2可見，與正常組比較，RA病/證組大鼠均出現(xiàn)了細胞因子表達紊亂狀態(tài)，其中RA組Activin A、CNTF、IFN-γ、TNF-α上調(diào)，MIP-3α、MMP-8下調(diào)；寒濕痹組CINC-2α、GM-CSF、IFN-γ上調(diào)，MIP-3α下調(diào)；濕熱痹組ICAM-1上調(diào)，IFN-γ、MIP-3α、RAGE下調(diào)。

表1 大鼠細胞因子抗體芯片

圖1 各組抗體芯片掃描結(jié)果Figure 1 Results of antibody chip scanning of each group

2.2.2 RA病/證大鼠各組間比較

由表3可見，與RA組比較，寒濕痹組β-NGF、CINC-2α、MMP-8、PDGF-AA上調(diào)，Activin A、TNF-α下調(diào)；濕熱痹組MMP-8上調(diào)，Activin A、CNTF、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MIP-3α、RAGE、TNF-α下調(diào)。寒濕痹組與濕熱痹組比較，CINC-2α、IFN-γ、IL-1α、MIP-3α、PDGF-AA、RAGE蛋白均上調(diào)，無明顯下調(diào)蛋白。

2.3 RA病/證大鼠血清IFN-γ/IL-4比值變化

與正常組相比，RA組及寒濕痹組的IFN-γ/IL-4比值升高，濕熱痹組比值明顯降低；與RA組比較，寒濕痹組比值升高，濕熱痹組比值明顯下降。見圖2。

表2 RA病/證大鼠與正常組大鼠的差異表達蛋白

注：Fold change閾值大于1.5，小于0.66者為差異表達蛋白。

Note.Fold change of greater than 1.5 or less than 0.66 represents a differentially expressed protein.

表3 RA病/證組間差異表達蛋白

注：Fold change閾值大于1.5和小于0.66者為差異表達蛋白。

Note. The fold change threshold greater than 1.5 or less than 0.66 is considered as differentially expressed protein.

注：各組IFN-γ/IL-4比值為標準化后灰度值的比值。圖2 RA病/證大鼠IFN-γ/IL-4比值的變化Note. The ratio of IFN-γ/IL-4 of each group is the ratio of the normalized gray value.Figure 2 Changes in the IFN-γ/IL-4 ratios of the rats in each group

3 討論

抗體芯片是蛋白質(zhì)芯片的一種，其技術(shù)原理是有序的將各種抗體固定在濾膜、載玻片等載體上，利用抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來捕捉樣本中待檢測的抗原，然后用標記的有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上對應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應(yīng)蛋白質(zhì)的表達情況。該技術(shù)利用少量樣本可篩選多項指標，具有高靈敏性、高特異性、高通量性的優(yōu)點，臨床上在疾病診斷、發(fā)現(xiàn)疾病標志物和評價治療效果等多方面有著廣泛的應(yīng)用。

Ⅱ型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)和佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)是目前最常用的類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型。CIA建立較早，也較為成熟，且與人類RA具有很多的相似性，是目前比較公認的研究RA的理想模型[5]。單純的CIA模型證候特征不明確，難以模擬“風寒濕三氣雜至，合而為痹”的證候特點，而單純的風寒濕和風濕熱環(huán)境因素并不能引起RA的病理學改變。然而，CIA動物模型在某些證候干預(yù)因素作用下，具備證候的潛質(zhì)，隨復(fù)加于CIA大鼠干預(yù)措施的不同，可將單純CIA模型轉(zhuǎn)化為腎虛、風寒濕、風濕熱等多種證候[6]。因此本實驗采用牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑皮內(nèi)注射復(fù)制大鼠類風濕關(guān)節(jié)炎模型，在RA模型基礎(chǔ)上采用條件可控的動物實驗箱模擬寒濕、濕熱環(huán)境因素，建立寒濕痹、濕熱痹病證結(jié)合模型。

目前，有關(guān)(風)寒濕痹、(風)濕熱痹病證模型的特異性評價指標尚處于探索階段，缺乏公認的評價標準。有研究發(fā)現(xiàn)，單純Ⅱ型膠原注射或Ⅱ型膠原加風寒濕環(huán)境刺激大鼠血清LDH含量較正常組大鼠明顯升高，而Ⅱ型膠原加風濕熱組低于正常組和Ⅱ型膠原加風寒濕組；Ⅱ型膠原注射加風寒濕環(huán)境刺激組血清IgG含量高于正常組，而單純Ⅱ型膠原注射或Ⅱ型膠原加風濕熱組與正常組無明顯差異[7]。CFA復(fù)加風寒濕刺激大鼠踝關(guān)節(jié)PGE2含量明顯高于正常組大鼠[8]，CFA及環(huán)瓜氨酸多肽(CCP)足跖注射復(fù)加寒濕、濕熱環(huán)境大鼠血清類風濕因子(RF)、anti-CCP滴度明顯高于單純CFA及CCP足跖注射大鼠，但濕熱與寒濕之間比較無統(tǒng)計學差異；單純造?；蛟炷?fù)加寒濕或濕熱環(huán)境均能使大鼠血清抗角蛋白抗體(AKA)、抗核周因子(APF)陽性率高于正常對照組，其中造模加濕熱環(huán)境的陽性率最高，造模加寒濕環(huán)境次之，但與單純造模無顯著性差異[9]。細胞因子是引起類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥及關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，故本研究從細胞因子表達譜著手，觀察寒濕痹、濕熱痹及單純RA大鼠相關(guān)細胞因子表達的情況，對上述模型的特征進行初步探索。結(jié)果顯示，RA病/證各組大鼠均出現(xiàn)了血清細胞因子表達譜紊亂狀態(tài)。與正常組比較，RA組及寒濕痹組多數(shù)細胞因子上調(diào)，如促炎因子IL-6、IFN-γ及GM-CSF等；濕熱痹組ICAM-1上調(diào)，IFN-γ、MIP-3α、RAGE下調(diào)。GM-CSF可刺激活化巨噬細胞分泌多種促炎性細胞因子如IL-6、TNF-性等，能促進炎癥的發(fā)展，加速細胞外基質(zhì)降解和細胞凋亡，并調(diào)節(jié)Th1型免疫應(yīng)答。CINC及MIP-3α為趨化因子，是可誘導的、分泌型的前炎癥細胞因子[10]，其中CINC與人IL-8有著類似的功能，介導細胞在炎癥部位聚集、活化以及組織損傷；但RA病/證模型與正常組相比，MIP-3α蛋白表達均下調(diào)，與文獻存在不一致性，有待進一步研究。CNTF能夠微弱抑制外周單核細胞產(chǎn)生IL-8和前列素E2，可在急性炎癥反應(yīng)中誘導肝細胞表達急性期反應(yīng)蛋白；ICAM-1對炎性反應(yīng)的發(fā)生起到一定作用，二者皆可反映炎癥情況。與RA組比較，寒濕刺激后β-NGF表達上調(diào)。有研究表明β-NGF被認為是疼痛發(fā)生過程中的重要因子，在創(chuàng)傷和炎癥部位其表達增加，提示寒濕刺激可增強RA模型的炎癥反應(yīng)[11]。MMP-8是Ⅱ型膠原降解的關(guān)鍵酶[12]，其在生理狀態(tài)下分泌很少，當受到炎性因子刺激后會大量產(chǎn)生，最終導致炎癥反應(yīng)。本研究顯示，在RA基礎(chǔ)上復(fù)加寒濕及濕熱刺激均可增強該酶的活性。Activin A可活化炎性細胞釋放促炎性因子，還可抑制M2型巨噬細胞分泌促炎因子PDGF[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)RA復(fù)加寒濕模型中activin A和PDGF表達呈負相關(guān)。RAGE作為調(diào)控炎癥因子重要信號通路HMGB1/NF-κB的關(guān)鍵蛋白[14]，在濕熱刺激下表達下調(diào)，具體環(huán)節(jié)還需進一步探究。

類風濕關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，但T細胞功能紊亂，尤其是輔助性CD4+T細胞異常活化，是RA發(fā)病過程中的重要機制[15]。在不同的特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下，輔助性T細胞(Th)分化為不同的細胞亞群，Th1/Th2兩種細胞亞群之間存在動態(tài)平衡及交互抑制，這種動態(tài)平衡一旦被打破，機體則處于Th1占優(yōu)勢或Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡狀態(tài)，并由此而發(fā)病。許多研究表明，RA屬Th1型疾病，Th1/Th2細胞失衡與RA發(fā)病機制密切相關(guān)。Th1分泌白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等細胞因子。IFN-γ是Th1細胞的特征性細胞因子，具有雙向的免疫調(diào)節(jié)作用，它既是單核巨噬細胞主要活化因子，間接發(fā)揮促炎作用，又可抑制滑膜成纖維細胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶等減少軟骨基質(zhì)降解發(fā)揮保護作用[16]。Th2則分泌白介素-4(IL-4)、IL-6等細胞因子，其中IL-4是Th2細胞分泌的特征抗炎性細胞因子，它有抑制Th1合成炎性細胞因子等功能。因此，通常用IFN-γ/IL-4的比值來代表Th1和Th2的比例。本研究中RA組及寒濕痹組促炎因子IFN-γ的表達上調(diào)，但濕熱痹組表達下調(diào)；RA病/證模型組與正常組相比IFN-γ/IL-4比值均出現(xiàn)明顯變化，RA組、寒濕痹組大鼠IFN-γ/IL-4比值明顯升高，濕熱痹組大鼠該比值則明顯降低。有研究證實，Th1/Th2細胞及細胞因子在類風濕關(guān)節(jié)炎不同的發(fā)展階段呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，在發(fā)病早期階段Th1細胞高于正常水平，Th2細胞隨著Th1細胞的升高而升高，隨著病程發(fā)展Th1細胞逐漸下降，Th2細胞反而升高從而抑制病情的發(fā)展[17]。本研究初步提示CIA大鼠寒濕刺激6周后Th1/Th2失衡加劇，濕熱刺激6周則可逆轉(zhuǎn)此失衡并向Th2型轉(zhuǎn)變。導致該變化的確切機制以及造模不同階段Th1/Th2變化規(guī)律尚需探究。

綜上，本研究應(yīng)用微陣列抗體芯片技術(shù)檢測了膠原誘導性關(guān)節(jié)炎病/證模型大鼠血清細胞因子表達譜的變化，結(jié)果提示病/證因素可影響相關(guān)細胞因子的表達，可為深入探討RA病/證特點及干預(yù)靶標提供一定參考，而細胞因子表達譜的動態(tài)變化規(guī)律尚需進一步研究。