李惠珍, 任展能, 李雅青, 楊碧瑩*, 杜寶新

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣州 510000；2.廣東省中醫(yī)院, 廣州 510000)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)，又名運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，是一種破壞性的神經(jīng)退行性疾病，引起上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害，運(yùn)動(dòng)功能喪失，最終導(dǎo)致患者死亡。目前該疾病病因未明，關(guān)于其發(fā)病存在較多假說，現(xiàn)階段普遍接受的是谷氨酸介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性；JPYF方是廣東省中醫(yī)院腦病四科杜寶新主任團(tuán)隊(duì)研發(fā)治療ALS的經(jīng)驗(yàn)復(fù)方，本課題組數(shù)十年的前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，JPYF方從肺脾論之對(duì)ALS患者有改善疾病預(yù)后的趨勢(shì)，一定程度上延緩疾病進(jìn)展；前期的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，JPYF方對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠起到延緩體重下降，延緩臨床發(fā)病時(shí)間，延長生存期，改善運(yùn)動(dòng)能力的作用，但均未進(jìn)一步闡明其分子生物學(xué)機(jī)制。近30年來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為谷氨酸的興奮性毒性是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變性、死亡的核心內(nèi)容[1]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其合成、釋放和回收均依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及其相關(guān)分子完成谷氨酸-谷氨酰胺這一循環(huán)[2]。EAAT2是清除突觸間隙谷氨酸的主力軍，在維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)和保護(hù)神經(jīng)元起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EAAT2的下調(diào)或功能失調(diào)，將引起多種神經(jīng)變性疾病，如癲癇、AD、ALS等[3]。為進(jìn)一步探討谷氨酸興奮性毒性在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究擬通過觀察JPYF方對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)幼鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的表達(dá)及對(duì)元代脊髓神經(jīng)元的影響,探討ALS的發(fā)病機(jī)制及JPYF方的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕14～16 d SPF級(jí)SD母鼠(15只)，體重290～350 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(粵)2013-0094]，待產(chǎn)，取新生24 h內(nèi)幼鼠以提取大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞；取胎鼠以提取脊髓神經(jīng)元。無菌手術(shù)在廣東省中醫(yī)院科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心生物安全柜進(jìn)行[SCXK(粵) 2013-0002]。本實(shí)驗(yàn)由廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理中心審核動(dòng)物倫理：倫理編號(hào)2017039。

1.1.2 JPYF方組成及凍干粉制備

黃芪30 g，黨參15 g，云苓10 g，白術(shù)15 g，五味子10 g，菟絲子10 g，麥冬10 g，陳皮5 g，法夏6 g，制馬錢子0.2 g，甘草6 g等均來自本院中藥房，購于康美藥業(yè)。雙蒸水(沒過藥物)浸泡3 h，煮沸1 h，10層紗布過濾，收集濾液；再加雙蒸水(沒過藥渣)，煮沸40 min，10層紗布過濾后合并濾液，濾液回旋冷凝濃縮，收集濃縮液，冷凍干燥得凍干粉，以兩劑生藥(222.4 g),制得206.2 g凍干粉；-80℃保存，備用。體外實(shí)驗(yàn)藥液配制：稱取1 g中藥凍干粉加入20 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，配置濃度為50 g/L的母液，震蕩至完全溶解，0.22 μm針頭濾器過濾，4℃保存?zhèn)溆茫看文敢菏褂弥芷诓怀^1周。

1.2 主要試劑與儀器

NeurobasalTMMedium培養(yǎng)基、谷氨酰胺、多聚賴氨酸(10888022、25030081、P1399)購自SIGMA；B-27(17504044)購自LIFE；FBS(1600044)購自GIBCO；馬血清(SH30074.03)購自Hyclone；GFAP、EAAT2、ChAT抗體(ab7260、ab41621、ab18736)購自Abcam；NEUN抗體(MAB377)購自Chemicon millipore公司；谷氨酸試劑盒(A074)購自南京建成；培養(yǎng)基A配制：89% DMEM/F12+10% FBS+1%雙抗；培養(yǎng)基B配制：90% DMEM/F12+5% FBS+4%馬血清+1%雙抗；培養(yǎng)基C配制：96.5% NeurobasalTM+2% B27+1%谷氨酰胺+0.5%雙抗。

冷凍干燥機(jī)ALPHA2-4/LSC(德國 Martin Christ公司)； Countstar 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 (美國 Inno-Alliance Biotech 公司)；多功能酶標(biāo)儀Victor X5(美國Perkin Elme公司)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡SZ61(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)；TS-1000 型脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元原代分離、提取與培養(yǎng)

取新生24 h內(nèi)SD幼鼠，斷頭處死，仔細(xì)提取大腦皮質(zhì)組織；胰酶+DNA酶消化20 min，取上清經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，重復(fù)3次；收集濾液，離心,懸液；差速貼壁30 min，取上清，重懸后調(diào)整密度到1×106/mL，于含有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3 d換液。培養(yǎng)至10 d左右將細(xì)胞至于37℃恒溫?fù)u床24 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞及其他雜質(zhì)細(xì)胞，收集純化細(xì)胞傳代備用。

取胎齡16天的SD孕鼠，麻醉、消毒，立即取出串珠樣子宮放入預(yù)冷培養(yǎng)基B中；參考上述步驟取胎鼠脊髓，調(diào)節(jié)密度1×105/mL，每孔0.1 mL接種到96孔板，每孔7×105接種于6孔板細(xì)胞爬片上(取材前一天用50 μmol/mL多聚賴氨酸包被4 h，晾干，PBS洗3次后烘干備用)，2 h后補(bǔ)足培養(yǎng)液，4～6 h后更換培養(yǎng)基C；之后每3 d半量換液。

1.3.2 IF法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元

收集對(duì)數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞種板于共聚焦培養(yǎng)皿中(或培養(yǎng)至6～7 d的神經(jīng)元細(xì)胞爬片)，次日PBS搖洗3次，每次10 min，4%多聚甲醛固定，0.3%曲通室溫通透20 min，搖洗，10%山羊血清室溫封閉60 min；一抗(星形膠質(zhì)：GFAP (1∶1500)；神經(jīng)元：ChAT(1∶500))4℃過夜；復(fù)溫，搖洗后，加入對(duì)應(yīng)種屬二抗(FITC(1∶200)和cy3(1∶300))37℃孵育1 h；DAPI染核5 min，搖洗；風(fēng)干，滴加熒光淬滅劑，晾干后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3 MTT法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力

調(diào)整星形膠質(zhì)細(xì)胞密度每孔1×104接種于96孔板，24 h后，吸去培養(yǎng)液，加入含JPYF方的培養(yǎng)液A預(yù)處理24 h(終濃度0.25、0.5、1 g/L) 分別為B、C、D組， PBS沖洗后處理同A組；谷氨酸(A)組：加入含谷氨酸培養(yǎng)液(250 μmoL/L培養(yǎng)4 h；對(duì)照(E)組：正常培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間的星形膠質(zhì)細(xì)胞，每組均6個(gè)復(fù)孔。藥物作用足夠時(shí)間后，去培養(yǎng)液，加入每孔110 μL含5% MTT的培養(yǎng)基，4 h后，吸去培養(yǎng)基加入每孔150 μL DMSO，震蕩混勻10 min，570 nm 波長檢測(cè)吸光度A，按照以下公式：細(xì)胞存活率=(A加藥組-A空白組) /(A正常組-A空白組) ×100%計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.4 IF法檢測(cè)EAAT2的熒光強(qiáng)度

將星形膠質(zhì)細(xì)胞每孔2萬接種于共聚焦培養(yǎng)皿，48 h后，分組處理同MTT法，藥物作用時(shí)間足夠后，進(jìn)行IF法檢測(cè)，(一抗EAAT2 (1∶500))，二抗(cy3(1∶500))。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)EAAT2蛋白的表達(dá)

將星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板，分組處理同MTT法。藥物作用時(shí)間足夠后，吸去原培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，每孔加入30 μL裂解液，充分裂解，刮板，收集裂解液，渦旋離心取上清，BCA測(cè)蛋白濃度，按每孔40 μg蛋白樣品，加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉60 min，洗凈封閉液，加入一抗(1∶1000)4℃過夜。次日加入二抗(1∶2000)孵育60 min。在PVDF膜上加入適量ECL顯影液，用Image Lab顯影成像并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 紫外比色法測(cè)定谷氨酸濃度

將星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板，分組處理同MTT法。藥物作用時(shí)間足夠后，收集各組上清培養(yǎng)液；嚴(yán)格按照谷氨酸試劑盒操作方法，取各組上清液、雙蒸水、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各50 μL于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，加入按比例配置好的工作液150 μL，混勻，340 nm 波長檢測(cè)各孔吸光度A1，每孔加入2 μL配置好的試劑五，充分混勻后，37℃孵育40 min，340 nm 波長檢測(cè)各孔吸光度A2；按照以下公式：谷氨酸濃度(μmol/L)=(測(cè)定A2值-測(cè)定A1值)-(空白A2值-空白A1值)/(標(biāo)準(zhǔn)A2值-標(biāo)準(zhǔn)A1值)-(空白A2值-空白A1值)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度(200 μmoL/L)*樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.7 IF法檢測(cè)神經(jīng)元存活情況

取各組培養(yǎng)基上清作用于培養(yǎng)至6～7 d的神經(jīng)元，培養(yǎng)4 h后，按IF法檢測(cè)各組神經(jīng)元存活情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件先進(jìn)行方差分析和齊性檢驗(yàn)，當(dāng)滿足正態(tài)分布及方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析；若不滿足采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有指標(biāo)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 IF法鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞

傳至第三代的星膠細(xì)胞，核呈圓球形常位于中央，胞突豐富，分支長而多，細(xì)胞之間聯(lián)系緊密；運(yùn)用GFAP特異性染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記成綠色所占DAPI核染比例為96%以上，結(jié)果見圖1。

圖1 熒光鏡下觀察、鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(IF， × 200，×400)Figure 1 Observation and identification of primary astrocytes under a fluorescence microscope

培養(yǎng)至6 d的脊髓神經(jīng)元，細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，核大而圓，胞體飽滿，立體感強(qiáng)，折光性好，突起細(xì)長，各細(xì)胞之前有聚集生長趨勢(shì)，軸突緊密聯(lián)系，Cy3標(biāo)記紅色所占DAPI核染比例為90%以上，結(jié)果見圖2。

2.2 MTT法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力

與正常組比較，谷氨酸造模組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，與造模組比較，不同濃度的JPYF方預(yù)處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并在0.25～1 g/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴，詳見表1、圖3。

圖2 熒光鏡下觀察、鑒定原代神經(jīng)元細(xì)胞(IF， × 200)Figure 2 Observation and identification of primary neuronal cells under a fluorescence microscope

表1 不同分組星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率

注：與正常組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01。

Note. Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group，dP<0.01.

注：與正常組比較,bP<0.01；與模型組比較， dP<0.01。圖3 谷氨酸對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響Note.Compared with the normal group, bP<0.01. Compared with the model group, dP<0.01.Figure 3 Effect of glutamate on the astrocyte viability

2.3 EAAT2蛋白表達(dá)情況

2.3.1 IF法檢測(cè)EAAT2蛋白熒光強(qiáng)度

與造模組比較，不同濃度JPYF方預(yù)處理組蛋白熒光強(qiáng)度比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，提示JPYF方可增加EAAT2蛋白的表達(dá)。詳見表2，圖4。

2.3.2 Western blot法檢測(cè)EAAT2蛋白表達(dá)

JPYF方預(yù)處理24 h，谷氨酸作用4 h后,對(duì)照組EAAT2蛋白有一定基礎(chǔ)表達(dá)，JPYF方組從0.25 g/L開始，隨著濃度增加，EAAT2蛋白表達(dá)依次提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示JPYF方可提高EAAT2蛋白水平。詳見圖5、圖6。

2.4 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度測(cè)定

與谷氨酸組比較， JPYF方預(yù)處理組上清谷氨酸濃度隨JPYF方濃度增高而下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，但均高于正常組。詳見表3、圖7。

表2 IF法檢測(cè)EAAT2蛋白熒光強(qiáng)度

注：與正常組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01。

Note. Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group，dP<0.01.

圖4 熒光鏡下觀察各組EAAT2蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of EAAT2 protein in each group was observed under a fluorescence microscope

注：與正常組比較,bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05, dP<0.01。圖5 Western blot法檢測(cè)EAAT2蛋白表達(dá)水平Note. Compared with the normal group,bP<0.01.Compared with the model group,cP<0.05, dP<0.01.Figure 5 Determination of EAAT2 protein expression levels by Western blotting

2.5 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清對(duì)原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的影響

與造模組比較，不同濃度JPYF方預(yù)處理組神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，提示健脾益肺方可提高EAAT2活性及蛋白水平，降低細(xì)胞外液谷氨酸含量，減少谷氨酸興奮性毒性，從而保護(hù)神經(jīng)元。詳見表4、圖8。

3 討論

本課題組結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)及查閱ALS相關(guān)古籍發(fā)現(xiàn)該病以肺脾兩虛為主者居多，中醫(yī)認(rèn)為“脾主肌肉，主四肢”，“肺主氣，司呼吸”， 脾為肺之母，肺為脾之子，故參考《脾胃論》補(bǔ)中益氣湯和《備急千金要方》補(bǔ)肺湯自擬治療ALS的經(jīng)驗(yàn)方；JPYF方以黃芪、黨參為君，補(bǔ)益肺脾之氣緩解臨床出現(xiàn)肢體肌無力、肌萎縮，氣短的患者，臣以白術(shù)、茯苓、麥冬補(bǔ)脾氣而生肺氣；佐以健脾理氣化痰之陳皮、

圖6 星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of EAAT2 protein in the astrocytes

組別Groups 原始給藥濃度(Original dose)健脾益肺方(g/kg) JPYF prescription谷氨酸(μmoL/L)Glutamate 上清液谷氨酸濃度(μmol/L)Supernatant glutamate concentration 谷氨酸組(Glutamate group)250113.98±11.19b0.2525094.30±4.80dJPYF方組(JPYF prescription group)0.525080.53±4.32d125064.47±0.30d正常組(Normal group)--26.09±1.22

注：與正常組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01。

Note.Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group,dP<0.01.

表4 熒光鏡下觀察不同原始給藥濃度組上清液對(duì)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞影響

注：與正常組比較，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05,dP<0.01。

Note.Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group，cP<0.05,dP<0.01.

法夏，使補(bǔ)而不膩，射干、杏仁宣肺利咽、開音散結(jié)，馬錢子健脾益氣，強(qiáng)肌，諸藥合用，已達(dá)健脾補(bǔ)肺強(qiáng)肌之效，前期臨床及基礎(chǔ)研究多有見效[4-6]；現(xiàn)代研究證明，中藥可減輕谷氨酸興奮性毒性，黃芪可明顯改善谷氨酸損傷后細(xì)胞的活性[7]，黃芪益母草注射液、人參皂甙R均可減輕神經(jīng)興奮毒性[8-9]。

肌萎縮側(cè)索硬化是一種主要累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性致死性神經(jīng)變性疾病，病變主要損害脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌萎縮、無力，80%～90%的患者于發(fā)病后3～5年因呼吸衰竭死亡[10]。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ALS 患者血漿和腦脊液中谷氨酸水平較正常人高[1]，在 ALS 模型小鼠的脊髓中也發(fā)現(xiàn)谷氨酸水平升高的情況[11]，認(rèn)為ALS的發(fā)病與谷氨酸興奮性毒性密切相關(guān)。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，胞外谷氨酸的代謝再循環(huán)只能依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAATs)來完成，EAATs分子的作用是通過再攝取來調(diào)節(jié)胞外谷氨酸的濃度，并因此保持胞外靜息狀態(tài)1～3 μmol/L的谷氨酸濃度[12]。EAAT2 是腦內(nèi)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)90%的谷氨酸再攝取，其表達(dá)主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上[13]。研究發(fā)現(xiàn)通過翻譯活化提高EAAT2表達(dá)，可以保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性損傷和死亡，延遲ALS動(dòng)物模型運(yùn)動(dòng)功能的下降和延長其壽命[14]。Rothstein等表示在ALS患者的尸解中谷氨酸鹽的功能性運(yùn)輸減少和EAAT2免疫反應(yīng)性降低[15-16]，并且轉(zhuǎn)基因小鼠中EAAT2的消耗會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[17]。Chen等組合編碼EAAT2、GDH2和NRF2的慢病毒三者協(xié)同作用可延緩ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病發(fā)展及改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)科量表評(píng)分[18]。

圖8 上清液處理后脊髓神經(jīng)元存活情況Figure 8 Survival of the spinal cord neurons after supernatant treatment

因此，本課題組不斷從轉(zhuǎn)運(yùn)體的角度研究能夠調(diào)節(jié)谷氨酸水平的方藥，提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)并維持其功能，從而有利于神經(jīng)元的保護(hù)。通過建立谷氨酸誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型探索JPYF方對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(EAAT2)表達(dá)的影響及可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JPYF方在一定范圍內(nèi)可顯著保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá)，降低細(xì)胞外液谷氨酸濃度，減少神經(jīng)元損害；然而，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型時(shí)，給予人體正常胞外水平的谷氨酸濃度并不能成功建立星形膠質(zhì)細(xì)胞損害模型，與正常組比較，細(xì)胞存活情況、形態(tài)及EAAT2的表達(dá)與正常組比較均無顯著差異，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示突觸傳遞過程中，囊泡釋放的Glu可使突觸間隙的濃度由靜息的1 μmoL/L升高到1.1 mmol/L，而維持在此峰值的時(shí)間僅約為1.2 ms相符合[19]；故研究人員篩選出適合本課題組實(shí)驗(yàn)的最佳給藥時(shí)間4 h及濃度250 μmoL/L；星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞均表達(dá)攝取谷氨酸的載體，星形膠質(zhì)細(xì)胞的攝取是清除突觸間隙谷氨酸的主要途徑，只有當(dāng)谷氨酸溢出時(shí)，神經(jīng)元的谷氨酸載體才發(fā)揮作用，引起谷氨酸興奮性毒性；本課題組在檢測(cè)培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)正常組谷氨酸濃度高于體內(nèi)正常胞外靜息狀態(tài)水平，這可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)基谷氨酸水平含量相關(guān)，而該濃度仍在溢出濃度之內(nèi)。

圖7 紫外比色法檢測(cè)各組培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度Figure 7 Concentrations of glutamic acid in each medium determined by UV colorimetric assay

綜上所述，JPYF方(0.25～1 g/L)呈濃度依賴的增加谷氨酸誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上EAAT2蛋白水平，降低谷氨酸濃度，保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性損傷和死亡。在今后的實(shí)驗(yàn)研究中，本課題組將會(huì)深入探索健脾益肺方對(duì)ALS的作用機(jī)制，期望研究成果為臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為ALS患者的綜合治療提供新的選擇。