張 怡，周曉紅，靳曉飛，董賢慧，于文濤，張 穎，成 媛，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省中醫(yī)藥防治心腦血管病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實驗室， 石家莊 050091)

中風(fēng)(stroke)具有高發(fā)病率及高致死致殘率的特點(diǎn)，是造成我國居民死亡的首位原因。中風(fēng)分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，其中大多數(shù)患者屬于缺血性中風(fēng)(87%)[1]。大量研究證實梗死組織周邊缺血半暗帶血流的恢復(fù)再通是減輕腦缺血臨床癥狀的最有效的治療策略，然而，伴隨而來的腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)的發(fā)生有時卻會造成更為嚴(yán)重的腦損傷[2]。腦組織中心缺血區(qū)內(nèi)神經(jīng)元以壞死為主，而缺血半暗帶內(nèi)可逆性的細(xì)胞凋亡是主要的細(xì)胞死亡機(jī)制，與最終的梗死面積密切相關(guān)[3]。中藥黃芪是傳統(tǒng)的益氣活血藥，在治療中風(fēng)方面具有數(shù)千年的歷史[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：黃芪注射液可有效減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[5]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，其是否能通過抑制細(xì)胞凋亡減輕缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen and glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/R)HT22細(xì)胞損傷有待進(jìn)一步探究。因此，本研究以常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的HT22細(xì)胞為對象，通過OGD/R模擬腦缺血再灌注損傷過程，探討黃芪甲苷在OGD/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及具體作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

HT22細(xì)胞(小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系)，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗中心許順江教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自BIOND公司；Triton X-100、多聚賴氨酸均購自北京索萊寶科技有限公司，Bcl-2單克隆抗體購自Abcam公司；Bax多克隆抗體、Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG、DAPI染液均購自武漢谷歌生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI 雙染色試劑盒購于BD公司；黃芪甲苷(純度>98%)購于上海源葉生物科技有限公司。

超凈工作臺SW-CJ-ID型購于蘇州凈化公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱3111型、三氣培養(yǎng)箱3131型及多功能微孔板讀數(shù)儀Varioskan LUX型購于Thermo公司；倒置顯微鏡DMI3000B型、熒光顯微鏡DM5000B型購于Leica公司；流式細(xì)胞儀FC 500 MCL 型購于Beckman公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HT22細(xì)胞培養(yǎng)

HT22細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液并置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2，飽和濕度)中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)1～2代后進(jìn)行OGD/R模型建立。

1.3.2 HT22細(xì)胞缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型的建立及實驗分組

將HT22細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對照組(Control)、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)組(Model)、黃芪甲苷組(AS-IV)和溶劑對照組(DMSO)。除正常對照組外，其余各組細(xì)胞均氧糖剝奪6 h后進(jìn)行復(fù)氧復(fù)糖，建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型：棄去HT22細(xì)胞正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)液)，PBS洗2次后加入DMEM無糖培養(yǎng)基，然后放入含94% N2+5% CO2+1% O2的37℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，將DMEM無糖培養(yǎng)基更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。AS-IV組于復(fù)氧復(fù)糖的同時給予黃芪甲苷處理(終濃度為100 μmol/L)，24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3.3 CCK-8測細(xì)胞活性

各組細(xì)胞于OGD/R 24 h 后分別于96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min后在多功能微孔板讀數(shù)儀中測OD 450 nm值，檢測細(xì)胞活性。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)Figure 1 Morphological observation of the cell morphology in each group under an optical microscope

1.3.4 LDH漏出率檢測

在96孔板中加入細(xì)胞上清液及LDH試劑，混勻，室溫靜置5 min后在多功能微孔板讀數(shù)儀中測OD 450 nm值，此為細(xì)胞上清中LDH釋放量。向原含細(xì)胞的培養(yǎng)板中加入1% Tritonx-100，室溫反應(yīng)20 min后取細(xì)胞反應(yīng)液及LDH試劑混勻，室溫靜置5 min，450 nm測定吸光值為細(xì)胞破膜液LDH釋放量。LDH漏出率(%)=上清LDH /(上清LDH+細(xì)胞破膜液LDH)×100%。

1.3.5 Bax、Bcl-2免疫熒光檢測

將細(xì)胞爬片用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)固定20 min；含1%Triton X-100的PBS液破膜15 min；BSA室溫孵育30 min；甩掉封閉液后先后滴加配好的Bax多克隆抗體(1∶100)和Bcl-2單克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜；PBS洗去一抗后滴加Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶300)和Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG(1∶100)，避光室溫孵育50 min；PBS洗去二抗后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；封片；每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行拍照。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

吸出并收集細(xì)胞上清液，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS清洗兩遍，加入100 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞后再分別加入FITC和PI染液各5 μL，室溫避光反應(yīng)15 min，加入400 μL 1×binding buffer，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖 HT22細(xì)胞的形態(tài)變化

Control組細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁生長，細(xì)胞呈兩極或多極，突起明顯，突起之間相互交織成網(wǎng)狀，胞體折光性強(qiáng)；與Control組相比，Model組和DMSO組細(xì)胞胞體突觸明顯減少，細(xì)胞皺縮、變圓，胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞間連接大量減少，細(xì)胞貼壁不緊，部分細(xì)胞團(tuán)脫落，胞體折光性下降；與Control組比較，AS-IV組上述表現(xiàn)有所緩解。見圖 1。

2.2 CCK-8檢測缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞活性

與Control組相比，Model組、DMSO組及AS- IV組細(xì)胞活性均顯著下降(P<0.05)；與Model組比較，AS- IV組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，DMSO組細(xì)胞活性無差別。見 圖2。

2.3 缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞LDH漏出率

與Control組相比，Model組、DMSO組及AS- IV組LDH漏出率均顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，AS- IV組LDH漏出率顯著降低(P<0.05)，DMSO組細(xì)胞LDH漏出率無差別。見圖3。

注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖2 缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞活性檢測Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 2 Viability of the HT22 cells treated by OGD/R was determined by CCK-8 assay

注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖3 缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞LDH漏出率Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 LDH level (%) of the HT22 cells treated by OGD/R

2.4 免疫熒光檢測缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)

與Control組相比，Model組細(xì)胞Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05)，AS-IV組細(xì)胞Bax/Bcl-2僅有升高趨勢(P>0.05)；與Model組比較，AS-IV組細(xì)胞Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞凋亡率

與Control組相比，Model組及AS-IV組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，AS-IV組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。實驗結(jié)果與免疫熒光檢測結(jié)果相似。見圖5。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是腦缺血溶栓治療及外科手術(shù)治療中的常見并發(fā)癥，指腦組織在缺血情況下恢復(fù)血流供應(yīng)后損傷加重的現(xiàn)象[6]。CIRI發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基過量生成、興奮性氨基酸毒性、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡等各種機(jī)制先后或重疊發(fā)生[7]，各種因素累積疊加，形成惡性循環(huán)，最終造成腦組織不可逆的損傷。

研究證實細(xì)胞凋亡為CIRI繼發(fā)性損傷發(fā)生的重要機(jī)制。腦缺血發(fā)生后，缺血中心區(qū)內(nèi)血流減少并伴隨著不可逆的神經(jīng)細(xì)胞壞死，而細(xì)胞凋亡則主要存在于缺血半暗帶并對最終腦梗死面積具有決定作用[8]。腦缺血后線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素C(cytochrome C)由線粒體釋放入胞質(zhì)，從而激活caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA降解[9]。此過程中，Bcl-2家族成員調(diào)控著蛋白的易位和激活[10]，CIRI后由于缺血等刺激使Bax易位至線粒體并增強(qiáng)線粒體膜通透性，導(dǎo)致cytochrome C和AIF的釋放，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Bcl-2則通過穩(wěn)定線粒體膜電位和阻止cytochrome C釋放來抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax兩者的比例是決定細(xì)胞凋亡發(fā)生與否的重要因素[11-12]。

注：熒光圖片：綠色，Bcl-2；紅色，Bax；藍(lán)色，DAPI。注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖4 免疫熒光染色檢測缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞Bax和Bcl-2的比例Note. Fluorescent images: green,Bcl-2；red, Bax；blue, DAPI. Compared with Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 4 Comperison of the Bax/Bcl-2 ratios of the OGD/R treated HT22 cells. Immunofluorescence staining

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞凋亡率Figure 5 Changes of the apoptosis rates in HT22 cells examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣固表、利尿消腫、托毒生肌之功效，臨床上常用于治療脾胃虛弱、表虛自汗、膿毒潰瘍、半身不遂等癥[13]。黃芪用于治療中風(fēng)具有數(shù)千年的歷史，更為治療缺血性中風(fēng)常用方——補(bǔ)陽還五湯中的君藥，目前廣泛應(yīng)用于臨床腦血管病的治療。黃芪甲苷為黃芪主要活性成分之一，具有清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎、抗血小板凝集等生物活性[14]。研究證實黃芪甲苷能有效降低腦缺血再灌注損傷小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，抑制caspase-3蛋白的表達(dá)，對受損腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。

缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖是一種公認(rèn)的用以模擬腦缺血再灌注損傷研究的體外模型[16]，本研究以HT22細(xì)胞為實驗對象，通過缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模擬腦缺血再灌注損傷過程，采用黃芪甲苷對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞進(jìn)行處理，旨在探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。研究結(jié)果證實：缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，LDH漏出率增加，細(xì)胞損傷嚴(yán)重；而給予黃芪甲苷處理后，細(xì)胞活力顯著升高，LDH漏出率顯著下降，細(xì)胞損傷明顯減輕，證實黃芪甲苷對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上又進(jìn)一步探索了黃芪甲苷的作用機(jī)制。通過觀察HT22細(xì)胞Bax/Bcl-2及凋亡率的變化，探索黃芪甲苷對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖導(dǎo)致HT22細(xì)胞Bax/Bcl-2及凋亡率顯著升高，細(xì)胞凋亡嚴(yán)重；而給予黃芪甲苷處理后HT22細(xì)胞Bax/Bcl-2及凋亡率均顯著下降，說明黃芪甲苷可通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞的保護(hù)作用?；谏鲜鲅芯?，本課題組擬通過離體和在體實驗兩方面進(jìn)一步探討黃芪甲苷發(fā)揮凋亡調(diào)控作用的具體通路。