浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

肝纖維化以肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化、增殖為主要特征，是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的重要病理過程。HSC的活化受氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）等諸多因素的影響，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1]。研究表明，生物體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）引起的OS在肝纖維化形成中扮演了重要角色[2]，而蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）在細(xì)胞的 OS反應(yīng)過程中起重要作用[3-5]，富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）則參與了 AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞蛋白合成，與心臟間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[6-7]，SRC也被認(rèn)為是AngⅡ調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號的關(guān)鍵成員。在血管平滑肌細(xì)胞中SRC以ROS依賴的方式被G蛋白激活，并調(diào)節(jié)諸如Pyk2、兩面神激酶（Janus kinases，JAK）/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transduction and activator of transcription，STAT）等下游信號。這些跡象提示，PKC、Pyk2、SRC很可能也參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，《金匱要略》所載鱉甲煎丸及其改良劑型鱉甲煎口服液能夠通過防止肝細(xì)胞變性、壞死；清除肝纖維化誘因；抑制HSC增殖；降低纖維化大鼠血漿中的腎素、AngⅡ、醛固酮活性；減少AngⅡ誘導(dǎo)HSC氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的羥自由基及單線態(tài)氧自由基等機(jī)制，從而抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[8-11]。

據(jù)此，筆者進(jìn)一步提出假設(shè)，在肝纖維化形成早期階段，AngⅡ誘導(dǎo)ROS作為初始的刺激因素，通過激活有PKC、Pyk2、SRC等諸多因子參與的信號網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致HSC增殖，以致形成肝纖維化。鱉甲煎丸能有效抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，可能與其對該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點的干預(yù)有關(guān)。本研究采用MTT、熒光探針DCFH-DA、Western blot及血清藥理學(xué)等研究方法，觀察鱉甲煎丸含藥血清對AngⅡ誘導(dǎo)的ROS作用下HSC-LX2細(xì)胞的增殖情況以及對PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)情況的影響，以初步探討其干預(yù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細(xì)胞 清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200g，購買于上海西普爾必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-2016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。5只/籠，25℃恒溫，光照12h/d，普通飼料喂養(yǎng)。人源肝星狀細(xì)胞HSC-LX2購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 主要實驗試劑和藥品 活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Solarbio公司（批號：CA1410、PC0020）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自 Vetec 公司（批號：V900090）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒、二抗羊抗兔、內(nèi)參β-actin均購自華安生物公司（批號：WK001、HA1001、CT36001）；Anti-Pyk2抗體、Anti-SRC 抗體、Anti-PKC alpha+beta 2+gamma抗體均購自Abcam公司（批號：[E354]ab32448、[EPR5496]ab109381、[EPR18104]ab184746）；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）購自弗德生物公司（批號：FD0011）；RPMI1640培養(yǎng)基購自 HyClone公司（批號：SH30809.01）；Beyo ECL plus購自碧云天公司（批號：P0018）；胎牛血清購自Diagnovum公司（批號：D154-500mL）。

鱉甲煎丸購自國藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司（批號：Z42020772）；依那普利購自揚子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司（批號：H32026567）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 MK-10干式恒溫器購于杭州奧盛儀器有限公司；L500臺式低速自動平衡離心機(jī)購于長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品；AE200倒置生物顯微鏡購于Motic公司；imark全自動酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；CLiNX掃膜儀購于Science Instruments公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清的制備 大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分成5組：鱉甲煎丸高、中、低劑量組，依那普利組及空白組。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，鱉甲煎丸高、中、低劑量組分別選用60kg成人每日總服用量的20、10、5倍。鱉甲煎丸以0.9%氯化鈉溶液溶解，高、中、低劑量組分別予12g/kg·d、6g/kg·d、3g/kg·d 灌胃給藥，灌胃體積 10mL/kg；依那普利組以10mg/kg·d劑量的依那普利溶液灌胃[11]，空白組以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均灌胃2次/d，連續(xù)給藥7d。末次給藥1h后，各組大鼠均在無菌條件下經(jīng)腹腔靜脈取血，4℃、3 000r/min離心20min分離血清，56℃滅活 30min，0.22μm 微孔濾膜過濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTT法測定鱉甲煎丸含藥血清對細(xì)胞增殖的影響 按前期研究方法[9]培養(yǎng)細(xì)胞，取對數(shù)生長期的HSC-LX2 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以 1×103～1×104個/孔的密度接種于96孔板，每孔終體積為100μL。將細(xì)胞分為AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組、空白血清組。各組以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁，向每孔加入新鮮制備的、經(jīng)濾膜濾過除菌的10-5mol·L-1AngⅡ處理1h，鱉甲煎丸高、中、低劑量組、依那普利組均分別設(shè)有4個濃度梯度，分別按5%、10%、15%、20%的終濃度加入相應(yīng)的含藥血清，空白血清組加入空白組大鼠血清，AngⅡ組加入胎牛血清。各組細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 24、48、72h 后，每孔加入5mg·mL-1MTT 20μL，37℃培養(yǎng) 4h后，徹底吸棄上清液，向每孔中加入150μL DMSO，置于搖床上振蕩10min，充分溶解藍(lán)紫色的甲臜沉淀，570nm波長檢測各孔吸光度值OD，代表細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化 收集對數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5×105個/mL的密度接種于24孔板，每孔500μL。培養(yǎng)24h后，將其分為空白對照組（培養(yǎng)液）、AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組和空白血清組。除空白對照組外，其余各組均以10-5mol/L AngⅡ處理1h，分別給予胎牛血清、依那普利含藥血清、10%鱉甲煎丸高、中、低劑量含藥血清及空白組大鼠血清。作用24h后，以PBS沖洗3次，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入適當(dāng)體積的DCFH-DA，DCFH-DA按照1:1000比例以無血清培養(yǎng)基稀釋，終濃度為10μmol·L-1，37℃孵育20min。再以無血清培養(yǎng)基洗滌3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光共聚焦顯微鏡觀察HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)的ROS，顏色越深，表明ROS生成量越多。

1.2.4 Western blot法檢測PKC-Pyk2/SRC通路中相關(guān)蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞分為AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組和空白血清組。先用10-5mol·L-1AngⅡ處理24h，然后分別予以各血清作用24h。參照前期研究[9]方法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量，制膠。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。稀釋一抗（PKC 1:1 000、Pyk2 1:500、SRC 1:10 000、β-actin 1:5 000），二抗（羊抗兔 lgG，稀釋比例1:2 000），室溫下?lián)u床孵育2h。脫色、覆膜后利用凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較 實驗結(jié)果顯示，各組中AngⅡ組與空白血清組細(xì)胞增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與AngⅡ組比較，處理24h后，5%鱉甲煎丸高、中劑量組顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖（P＜0.05，P＜0.01），10%、15%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。處理48h后，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸高、中、低劑量組均顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；15%鱉甲煎丸高劑量組可顯著抑制HSCLX2細(xì)胞增殖活性（P＜0.05）；10%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。培養(yǎng)72h后，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸中劑量組顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.01），10%、15%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 3。

2.2 各組HSC-LX2細(xì)胞ROS含量比較 采用熒光共聚焦顯微鏡直接觀察HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化，ROS的表達(dá)在HSC-LX2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)為綠色的熒光顆粒，綠色越深，分布越密集，表明ROS含量越高?？瞻讓φ战M綠色熒光顆粒顏色較淺，分布散在、稀疏；與空白對照組比較，AngⅡ組綠色熒光顆粒顏色加深，分布較密集；依那普利組綠色熒光顆粒明顯少于AngⅡ組，且分布稀疏；鱉甲煎丸高劑量組綠色熒光顆粒密集程度與空白對照組和依那普利組相似，但顏色略淡；鱉甲煎丸中劑量組綠色熒光顆粒略多，且顏色加深；低劑量組，綠色熒光顆粒較明顯，密集程度與AngⅡ組相似；空白血清組綠色熒光顆粒顏色不深，分布較為稀疏。見圖4。說明與空白對照組比較，AngⅡ組ROS含量明顯提高；與AngⅡ組比較，依那普利組、鱉甲煎丸高、中劑量組ROS含量降低，低劑量組的變化不大。

圖1 作用24h后各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.1 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cell in each group after treatment of 24h

圖2 作用48h各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.2 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cell in each group after treatment of 48h

圖3 作用72h后各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.3 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cells in each group after treatment of 72h

圖4 熒光共聚焦顯微鏡檢測HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS含量Fig.4 Fluorescence confocal microscopy to detect ROS content in HSC-LX2 cell

2.3 各組HSC-LX2細(xì)胞PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)比較 與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組PKC 表達(dá)減低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組PKC表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白血清組比較，鱉甲煎丸中、低劑量組 Pyk2 的表達(dá)減低（P＜0.01，P＜0.001）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組Pyk2的表達(dá)明顯減低（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001）。與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組SRC表達(dá)明顯減低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中劑量組SRC表達(dá)減低（P＜0.05，P＜0.05）。見圖 5。

圖5 各組HSC-LX2細(xì)胞PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of protein expression of PKC,Pyk2 and SRC in each group

3 討論

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分異常沉積，并影響肝臟的功能，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，其病因大致可分為感染性、先天性代謝缺陷、化學(xué)毒物性、自身免疫性肝病等。目前認(rèn)為，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC的激活和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是抗纖維化研究的熱點。對慢性肝臟疾病動物模型的研究已證實了疾病發(fā)展過程中存在著氧化應(yīng)激作用。還有研究證實，AngⅡ在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可促進(jìn)肝纖維化的形成[12]。

為了探索AngⅡ?qū)SC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響，筆者采用AngⅡ刺激HSC-LX2細(xì)胞，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，AngⅡ組ROS產(chǎn)生明顯增多，經(jīng)鱉甲煎丸高、中劑量組含藥血清干預(yù)后，ROS均不同程度減少。這提示AngⅡ可以誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，鱉甲煎丸對此具抑制作用。

為了觀察鱉甲煎丸對HSC-LX2細(xì)胞增殖活性的影響是否存在時效、量效關(guān)系，筆者選用不同濃度（5%、10%、15%、20%）的高、中、低劑量鱉甲煎丸含藥血清，分別干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞24、48、72h，用MTT法觀察細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸含藥血清培養(yǎng)24h后，高、中劑量組顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖；48h后，高、中、低劑量組均能顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖；72h后，中劑量組有顯著抑制效果。此外，除了15%中劑量鱉甲煎丸含藥血清培養(yǎng)48h后有顯著抑制效果，其余各組、各時間段均無顯著抑制作用。由此可見，5%含藥血清干預(yù)48h的增殖抑制作用最明顯，各劑量組之間沒有呈現(xiàn)出量效關(guān)系。究其原因主要有以下兩方面：一方面含藥血清制備尚無統(tǒng)一的給藥方案[13]，本研究采用不同劑量鱉甲煎丸連續(xù)灌胃7d，2次/d的方法，然后取血制備含藥血清。經(jīng)過大鼠機(jī)體的代謝，各劑量組血藥濃度是否仍有明顯差異，尚不確定。另一方面培養(yǎng)液中含藥血清的濃度過高有可能反而降低細(xì)胞對藥物的敏感性。從本研究的結(jié)果看，5%的含藥血清濃度較為適宜。

AngⅡ能夠刺激HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS并增殖，涉及的環(huán)節(jié)錯綜復(fù)雜。PKC、Pyk2和SRC很可能也參與其中。PKC屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛存在于機(jī)體的組織細(xì)胞內(nèi)，它被多種因素激活后，可通過磷酸化下游蛋白、激活蛋白激酶和誘導(dǎo)幾種核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的OS反應(yīng)[3-5]。Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ組中胎牛血清對PKC表達(dá)的抑制較明顯，空白血清組的PKC表達(dá)明顯增強(qiáng)。經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后，PKC的表達(dá)同樣受到抑制。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果可知，PKC參與了AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖過程，鱉甲煎丸可抑制PKC的表達(dá)。

Pyk2是粘著斑激酶FAK家族重要成員之一，參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/STAT、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）等多條信號通路的傳遞，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、凋亡和黏附等生理過程。在AngⅡ的刺激下，Pyk2是多種細(xì)胞信號途徑的一種上游調(diào)節(jié)因子，參與了AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞蛋白合成，有望成為心臟間質(zhì)纖維化防治的新靶點[14-15]。本研究結(jié)果提示，與空白血清組比較，AngⅡ組Pyk2表達(dá)增強(qiáng)，經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后，Pyk2蛋白表達(dá)受到抑制。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果，筆者認(rèn)為Pyk2也參與了AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖過程，可以將其作為防治肝纖維化的潛在靶點，而鱉甲煎丸對其表達(dá)具有抑制作用。

SRC被認(rèn)為是AngⅡ調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號的關(guān)鍵成員。在血管平滑肌細(xì)胞中SRC以ROS依賴的方式被G蛋白激活，并調(diào)節(jié)諸如Pyk2、JAK/STAT等下游信號。在AngⅡ作用下，Pyk2和SRC、PI3K等共同導(dǎo)致了細(xì)胞生長及局部黏附。ROS能夠以直接或間接的方式激活SRC，SRC反過來通過一系列的信號通路對ROS具有調(diào)節(jié)作用，許多研究已經(jīng)表明SRC能夠呈正反饋地促進(jìn)ROS的生成[16-17]。本研究結(jié)果提示，與AngⅡ組比較，SRC對空白血清組中的大鼠血清更敏感，而鱉甲煎丸含藥血清對SRC表達(dá)有顯著的抑制作用。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果，筆者認(rèn)為SRC是AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖的促進(jìn)因素，而鱉甲煎丸可抑制其表達(dá)。

綜合分析實驗結(jié)果，筆者得出以下結(jié)論：AngⅡ可以誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，繼而影響PKC、Pyk2、SRC蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。鱉甲煎丸可通過抑制ROS的產(chǎn)生，下調(diào)PKC、Pyk2、SRC蛋白的表達(dá)，從而抑制HSC-LX2細(xì)胞的增殖。PKC、Pyk2、SRC諸蛋白在其中的調(diào)控機(jī)制，將在后續(xù)研究中采用siRNA技術(shù)予以探討。