唐存祥 倪衛(wèi)東 凌 云 陳永堂 劉玉娟

1 浙江省長興縣中醫(yī)院 浙江 長興 313100

2 江蘇省句容市中醫(yī)院 江蘇 句容 212400

3 南京中醫(yī)藥大學 江蘇 南京 210000

4 山東省青島市第六人民醫(yī)院 山東 青島 266000

肝纖維化是各種慢性肝病在發(fā)展至肝硬化過程中的必經(jīng)病理變化。多種細胞因子介入肝纖維化發(fā)展，是肝星狀細胞（HSC）活化及細胞外基質（ECM）沉積和增加的重要因素。目前研究表明胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP7）可通過ERK1/2通路激活HSC、誘導ECM沉積，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。本研究通過實驗，觀察大鼠體內IGFBP7的表達，以探討雪蟾膠囊抗肝纖維化作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料:SD雄性大鼠32只，180g～200g，購自南京拜睿生物有限公司。雪蟾膠囊，購自上海綠雅堂醫(yī)療公司。秋水仙堿，購自云南昆藥集團公司。ELISA試劑盒購自慧嘉生物有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測儀購自RAYTO RT-6000，37℃孵育箱購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 動物造模及分組:本實驗取大鼠5只作為正常組，27只用來制作肝纖維化模型。將造模大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，給予高脂、低蛋白質飼料（豬油20%+膽固醇0.5%+玉米粉79.5%）2周，再皮下注射40%四氯化碳（CCL4）橄欖油溶液，3ml/kg，3次/周，持續(xù)4周。造模結束，隨機處死2只，確定造模成功。將余下造模成功的25只大鼠按隨機數(shù)字表法平分為5組，即:模型組、秋水仙堿組、雪蟾膠囊低、中、高劑量組。藥物組每日分別給予秋水仙堿（0.1mg/kg）、雪蟾膠囊（按低、中、高劑量分組分別給予0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg），灌胃給藥，連續(xù)4周。模型組及正常組按10ml/kg·d生理鹽水灌胃。

1.3 ELISA檢測IGFBP7的表達:在第11周末，大鼠末次給藥后禁食、自由飲水15h，用10%水合氯醛（4.0ml/kg）腹腔注射麻醉，開腹，腹主動脈采血，分離血清作為樣品。加一定稀釋的樣品0.1ml于已包被之反應孔中，置37℃孵育1h。同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔。PBST洗滌5次，每次30s。各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml，37℃孵育0.5～1h。再PBST洗滌5次，每次30s，加臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃，10～30min，使底物液顯色。各孔加入2M硫酸0.05ml終止反應。

2 結果

相對于模型組，各組大鼠血清中IGFBP7均有明顯下降（P＜0.05）。在抑制大鼠血清中IGFBP7的相對表達量方面，雪蟾膠囊3個劑量組呈現(xiàn)一定的量效關系，且雪蟾膠囊高劑量組優(yōu)于秋水仙堿組。見表1。

表1 各組的IGFBP7指標檢測結果（±s)

表1 各組的IGFBP7指標檢測結果（±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05；與高劑量組比較，ΔP＜0.05。

分組正常組模型組秋水仙堿組雪蟾膠囊低劑量組雪蟾膠囊中劑量組雪蟾膠囊高劑量組IGFBP7（ng/ml）101.51±13.70*824.04±65.83 216.87±24.32*Δ 647.88±23.65*Δ 299.39±28.67*Δ 136.87±9.55*例數(shù)5 5 5 5 5 5

3 討論

肝纖維化可歸屬于中醫(yī)學“癥積”“鼓脹”“脅痛”“黃疸”等范疇。其病機虛實夾雜，以“正虛血瘀”為主，可夾雜濕熱、氣郁、痰濁等因素[2]。雪蟾膠囊主要成分為干蟾皮、雪靈芝。《本草綱目拾遺》曰:“蟾皮，此乃癩蝦蟆皮也，能拔大毒外出，又能回毒?！毖╈`芝性味甘寒，入肝、膽、脾經(jīng)，清熱解毒，滋陰養(yǎng)血，益腎壯骨，利膽除黃。二者合用在消積、除濕、解毒的同時，扶助正氣，補益肝腎，組方符合肝纖維化“虛實夾雜”病機。結果提示，雪蟾膠囊抗肝纖維化作用，可能與抑制IGFBP7的表達有關。同時，隨著劑量的增加，抑制IGFBP7表達效果越好。與西藥秋水仙堿組比較，雪蟾膠囊高劑量組對于IFGBP7的表達抑制更強。能否以雪蟾膠囊替代秋水仙堿抗肝纖維化治療，需進一步觀察。