巴燕娜，蘇麗萍，袁 晴，董海瑩△

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院臨床免疫科，西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室，西安 710032)

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種以淚腺和唾液腺病變及淋巴細(xì)胞浸潤為主要特征并由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性風(fēng)濕性炎癥疾病。然而除了外分泌腺體的病變之外，pSS也能影響機(jī)體的其他器官，表現(xiàn)出機(jī)體體征和癥狀的多樣性[1-2]。研究表明pSS患者死亡主要是由實(shí)體腫瘤、感染、淋巴瘤和心血管疾病等因素造成[3]。由于pSS在不同的個體中表現(xiàn)出不同的癥狀，患者預(yù)期壽命和原發(fā)病相關(guān)[1]。然而，目前對于pSS患者的治療目標(biāo)只是緩解癥狀、抑制過度的自身免疫反應(yīng)、損傷預(yù)防及生活質(zhì)量的改善[4]，還沒研發(fā)出直接治療pSS的藥物。此外，為了闡明pSS發(fā)病機(jī)制，研究人員從細(xì)胞分子水平特征上對pSS患者特征進(jìn)行了大量的研究，研究包括全基因組關(guān)聯(lián)分析[5]、表觀基因組[6]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[7]、血清標(biāo)志物的鑒定[8]、代謝組學(xué)[9]和免疫表型研究[10]。盡管對pSS的分子特征進(jìn)行了全面的研究，但是pSS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，還需要進(jìn)一步了解和探索[10]。

除了細(xì)胞核，線粒體是人體細(xì)胞中唯一具有基因組的細(xì)胞器。線粒體基因組由37個基因組成，其中的13個基因編碼線粒體自身需要的蛋白質(zhì)，其他的線粒體所需的蛋白質(zhì)由核基因組的基因編碼[11]。隨著人們對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能研究不斷加深，人們認(rèn)識到除了為機(jī)體提供能量之外，線粒體在鈣離子的穩(wěn)態(tài)、產(chǎn)生活性氧ROS、調(diào)控細(xì)胞的凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)等過程中扮演重要角色[12]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能的異常與多數(shù)的疾病相關(guān)，這些疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病等[13-14]。

以往研究[15]闡明維持線粒體的穩(wěn)態(tài)能夠控制自身免疫進(jìn)程。因此，線粒體功能與機(jī)體的自身免疫相關(guān)。然而pSS作為一種自身免疫性疾病與線粒體之間的相關(guān)機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究表明與凋亡相關(guān)的線粒體蛋白細(xì)胞色素C和SMAC在pSS患者中高表達(dá)，提示細(xì)胞色素C和SMAC在pSS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[16]。此外，有研究[17]發(fā)現(xiàn)pSS患者中存在含抗線粒體抗體(AMA)，AMA是表現(xiàn)出肝功能異常的pSS患者的血清標(biāo)志。目前，對于線粒體功能和pSS之間的關(guān)系尚不明確，而基于差異表達(dá)基因分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有助于發(fā)現(xiàn)線粒體和pSS之間的相關(guān)機(jī)制，有利于推進(jìn)pSS相關(guān)研究的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1材料 線粒體功能相關(guān)基因的注釋信息來源于NCBI和MitoMiner數(shù)據(jù)庫。線粒體功能相關(guān)基因包括兩種，一種是線粒體自身編碼的基因，即線粒體基因；另一種是核基因組編碼且編碼蛋白質(zhì)定位于線粒體的基因，即線粒體相關(guān)基因。其中，NCBI數(shù)據(jù)庫提供的線粒體參考基因組共包含37個線粒體基因。MitoMiner數(shù)據(jù)庫的IMPI(Integrated Mitochondrial Protein Index)[18]提供了1 626個線粒體功能相關(guān)基因，去除13個線粒體基因，線粒體相關(guān)基因由1 613個基因組成。本文采用的pSS相關(guān)的基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫，樣本來源為細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，樣本量共60例(30例患者，30名健康人)，探針54 613個，基因20 486個。線粒體功能相關(guān)基因在基因芯片表達(dá)譜的檢出情況：數(shù)據(jù)集GSE84844中包含線粒體相關(guān)基因1 537個，線粒體基因6個，檢測率分別為95.29%和16.22%。

1.2方法

1.2.1基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理 本文使用的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于Affymetrix平臺檢測的基因芯片數(shù)據(jù)，其原始數(shù)據(jù)CEL文件需要經(jīng)過預(yù)處理，以下是數(shù)據(jù)預(yù)處理的步驟：(1)運(yùn)用RMA算法[19]對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化運(yùn)算并進(jìn)行以2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換，基因表達(dá)值的取值范圍在0～16。(2)利用GEO數(shù)據(jù)庫中GPL570平臺的注釋信息，將原始表達(dá)譜中的探針對應(yīng)成Entrez Gene ID。在對應(yīng)的過程中，去除對應(yīng)到多個Entrez Gene ID的探針及其對應(yīng)的基因表達(dá)值。同時，將多個探針對應(yīng)成一個Entrez Gene ID的表達(dá)值取平均值，得到數(shù)據(jù)預(yù)處理后的基因表達(dá)譜。

1.2.2篩選差異表達(dá)基因 在pSS組和正常組的樣本中，本文使用的差異基因分析方法為雙總體學(xué)生t檢驗(yàn)和FC(Fold Change)。采用多重檢驗(yàn)校正的方法Benjamini-Hochberg對P值進(jìn)行校正，并控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)。本文設(shè)置FDR<0.05且表達(dá)值變化1.5倍以上的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.2.3KEGG功能富集和GO功能注釋 為了分析差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因涉及哪些生物學(xué)通路，從而能進(jìn)一步分析線粒體的異?？赡軄碓从谀男┕δ苌系漠惓?。本文針對差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因進(jìn)行KEGG功能富集和GO功能注釋，采用的通路信息和注釋信息分別來源于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[20]和GO(Gene Ontology)[21]數(shù)據(jù)庫。本文基于R語言clusterProfiler包來實(shí)現(xiàn)這一過程，設(shè)置P<0.05富集的通路和注釋的GO術(shù)語具有顯著性。此外，GO注釋過程中的基因功能類型為基因參與的生物學(xué)過程。

1.2.4蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 為了解差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因與其他基因之間相互作用的情況并尋找在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中的Hub節(jié)點(diǎn)即網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，本文采用STEING[22]蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)互作信息進(jìn)行分析，并采用Cytoscape軟件繪制了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。在分析的過程中，本文基于R語言igraph包計算出蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中每一個節(jié)點(diǎn)的度、介數(shù)和接近中心度，并設(shè)置度、介數(shù)和接近中心度排名都在前10的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的Hub節(jié)點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1篩選差異表達(dá)基因 本文在pSS組和正常組的基因表達(dá)譜中，采用t檢驗(yàn)和FC的差異基因分析方法設(shè)置FDR<0.05且表達(dá)值變化1.5倍以上共篩選出347個pSS相關(guān)的顯著差異表達(dá)基因(見表1)。其中，顯著差異表達(dá)的線粒體相關(guān)基因有61個。在60個上調(diào)的基因中，pSS組相對于正常組基因表達(dá)值的倍數(shù)變化在2倍以上的基因有UQCRQ、XAF1、NDUFA4、MRPS28、IFIT3、OAS1、IFI6、CMPK2和IFI27，1個下調(diào)的基因?yàn)镸YH9，詳細(xì)的信息見表2。其中，倍數(shù)變化最大的基因是IFI27即干擾素誘導(dǎo)蛋白27，其FC值為23.35(10.23)。另外，本文使用的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中檢測了6個線粒體基因，分別為MT-ND6、MT-CO2、MT-ND2、MT-CO1、MT-ND4和MT-ATP6，而MT-ND2基因即泛醌氧化還原酶核心亞基2表現(xiàn)出基因表達(dá)值的下調(diào)，pSS組的基因表達(dá)值是正常組的0.61倍。由此說明了pSS的發(fā)生伴隨著部分線粒體功能相關(guān)的基因表達(dá)的失調(diào)。由此推測線粒體功能的異常在pSS中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，但具體的機(jī)制尚不明確?；鹕綀D見圖1。

表1 pSS組相對于正常組顯著差異表達(dá)情況

上調(diào)：指pSS組相對于正常組基因表達(dá)值的上調(diào)，下調(diào)：指pSS組相對于正常組基因表達(dá)值的下調(diào)

2.2差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因的功能富集與功能注釋 為了解線粒體功能相關(guān)基因的異常表達(dá)會影響機(jī)體的哪些生物學(xué)通路，圖2和圖3分別展示了對62個差異表達(dá)的線粒體功能相關(guān)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG功能富集的結(jié)果。本文設(shè)置P<0.05的GO術(shù)語和KEGG通路具有顯著性，最終富集到138條GO術(shù)語和3條KEGG通路，圖2只展示了最顯著的33條GO術(shù)語。從結(jié)果可以看出，62個線粒體功能相關(guān)基因的異常表達(dá)主要影響氧化磷酸化、電子傳遞鏈、質(zhì)子跨膜運(yùn)輸、線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程、核苷酸代謝以及細(xì)胞色素C的釋放過程等與細(xì)胞能量供應(yīng)、細(xì)胞凋亡及核苷酸代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。因此，pSS的發(fā)生、發(fā)展可能會出現(xiàn)線粒體能量供應(yīng)異常、細(xì)胞的凋亡、線粒體基因組轉(zhuǎn)錄翻譯及核苷酸代謝失控的狀態(tài)。

火山圖展示了20 486個基因在pSS組和正常組中基因表達(dá)值的變化情況。紅色的點(diǎn)表示顯著表達(dá)上調(diào)基因，綠色的點(diǎn)表示顯著表達(dá)下調(diào)基因，而黑色的點(diǎn)表示表達(dá)水平低于給定閾值而被認(rèn)為沒有顯著差異的基因。橫坐標(biāo)為log2FC表示pSS組相對于正常組基因表達(dá)值的倍數(shù)變換經(jīng)過以2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換，其絕對值越大表示差異越大?？v坐標(biāo)為-log10FDR表示FDR值經(jīng)過以10為底的負(fù)對數(shù)轉(zhuǎn)換，值越大表示差異越顯著。此外，本文篩選差異表達(dá)基因的條件為FDR<0.05且表達(dá)值變化1.5倍以上，在圖中表現(xiàn)為3條虛線。兩條垂直的虛線分別表示-log21.5和log21.5，水平虛線為-log100.05

圖1火山圖

表2 倍數(shù)變化較大的差異表達(dá)顯著的線粒體相關(guān)基因

2.3差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò) 為了解差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因與其他基因之間相互作用情況，圖4展示了62個差異表達(dá)的線粒體功能相關(guān)基因與其他基因之間的相互作用關(guān)系，綠色的點(diǎn)表示表達(dá)上調(diào)的基因，藍(lán)色的點(diǎn)表示表達(dá)下調(diào)的基因。該蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的Hub節(jié)點(diǎn)即度、介數(shù)和接近中心度都排在前10的節(jié)點(diǎn)為RPL31、RPS17、ATP5C1和UQCRQ。其中，RPL31、RPS17和UQCRQ為表達(dá)上調(diào)的線粒體相關(guān)基因，ATP5C1并非為差異表達(dá)基因。表3展示了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中度、介數(shù)、接近中心度排名前10的基因。Hub節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用。因此，線粒體功能的異?？赡芘cRPL31、RPS17和UQCRQ的失調(diào)息息相關(guān)，其可能是pSS進(jìn)展的重要因素。

圖中只展示了最顯著的33條GO術(shù)語

圖2 62個顯著差異表達(dá)的線粒體功能相關(guān)基因注釋GO術(shù)語

圖3 62個顯著差異表達(dá)的線粒體功能相關(guān)基因富集的KEGG通路

綠色表示上調(diào)基因；藍(lán)色表示下調(diào)基因

圖4差異表達(dá)顯著的線粒體功能相關(guān)基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

自身免疫性疾病pSS的多表征特點(diǎn)是臨床診斷和治療的問題和挑戰(zhàn)，pSS發(fā)生的機(jī)制尚不明確。有研究表明線粒體功能和機(jī)體的自身免疫過程息息相關(guān)[15]，但線粒體功能和pSS之間的關(guān)系尚不明確。為了研究線粒體和pSS之間的關(guān)系，本文旨在從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的層面利用細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞標(biāo)本的基因表達(dá)譜芯片分析線粒體功能相關(guān)基因在pSS組和正常組中的差異表達(dá)情況。通過t檢驗(yàn)和FC差異基因分析方法，本文共找出62個線粒體功能相關(guān)基因在pSS患者的表達(dá)中發(fā)生了失調(diào)，其中1個差異表達(dá)基因是線粒體自身編碼的基因。這些異常表達(dá)的線粒體功能基因主要涉及細(xì)胞的能量供應(yīng)、核苷酸代謝、細(xì)胞凋亡(細(xì)胞色素C的釋放)和線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等生物學(xué)過程。由此說明pSS伴隨著上述生物學(xué)過程的失調(diào)，提示線粒體和pSS發(fā)生發(fā)展之間有關(guān)聯(lián)。

DisGeNET數(shù)據(jù)庫[24]提供了和疾病相關(guān)基因的數(shù)據(jù)信息，其提供了78個和pSS相關(guān)且在基因表達(dá)上出現(xiàn)異常的基因。本文使用的基因芯片數(shù)據(jù)GPL570平臺檢測的基因中只包含56個pSS相關(guān)的基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)基因芯片數(shù)據(jù)中的347個差異表達(dá)基因只有4個基因是DisGeNET提供的pSS相關(guān)的基因。此外，先前的研究指出OAS1、IFI27和IFIT3這3個差異表達(dá)的線粒體功能相關(guān)基因與pSS的發(fā)生相關(guān)[23,25]，而這3個基因不屬于DisGeNET數(shù)據(jù)提供的78個基因。因此，本文分析的結(jié)果中部分的差異表達(dá)基因與pSS的發(fā)生相關(guān)得到了證實(shí)，其余的基因需要進(jìn)一步的功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析中識別出RPL31、RPS17、ATP5C1和UQCRQ為網(wǎng)絡(luò)中的Hub節(jié)點(diǎn)，其在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，這4個基因的異?？赡苁蔷€粒體功能異常的重要因素，其異常表達(dá)將可能推進(jìn)pSS的發(fā)生發(fā)展。因此，后續(xù)的功能性實(shí)驗(yàn)首要考慮的基因是上述的4個基因。

此外，本文還存在部分不足的地方。首先，本文基于基因芯片的表達(dá)譜數(shù)據(jù)來分析，由于平臺檢測的基因范圍有限，只檢測了95.29%的線粒體相關(guān)基因及16.22%的線粒體基因，其余未檢測到的線粒體功能相關(guān)基因并不能說明它們與pSS的發(fā)生和發(fā)展無關(guān)。因此，需要有能檢測到這些線粒體相關(guān)基因來進(jìn)一步研究基因的表達(dá)異常與pSS之間的關(guān)系，以此來建立線粒體和pSS之間的關(guān)系。其次，本文是基于轉(zhuǎn)錄組的層面進(jìn)行相關(guān)研究，尚未考慮在其他組學(xué)如基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組等多維組學(xué)層面分析線粒體功能和pSS之間的關(guān)系。此外，本文只使用1個基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析，基于實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性考慮，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待可重復(fù)性驗(yàn)證或者后續(xù)的功能性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。最后，本文分析所用的數(shù)據(jù)是細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)譜，考慮pSS具有多表征和個體間存在異質(zhì)性的特點(diǎn)，不同的取樣部位可能導(dǎo)致不同的分析結(jié)果。因此，本文分析的結(jié)果只適用于部分的pSS患者，并非適用于所有pSS患者。

綜上，本文利用生物信息學(xué)的研究方法在轉(zhuǎn)錄組水平上分析了線粒體功能相關(guān)基因在pSS患者的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)線粒體能量供應(yīng)、線粒體基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞凋亡及核苷酸代謝等功能的異常與pSS相關(guān)。本文的研究結(jié)果揭示了線粒體與pSS疾病的相關(guān)性，有助于推動線粒體與pSS疾病關(guān)聯(lián)研究的深入開展。