馮云霞，張介眉，謝沛霖，郝建軍，朱 旭

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 430000)

血脂異常與心腦血管疾病密切相關(guān)，是冠心病和缺血性腦卒中獨(dú)立危險(xiǎn)因素，血脂異常已成為影響我國(guó)人群健康的重要公共衛(wèi)生問題[1]。本課題組歷時(shí)十余年開發(fā)研制的蔥白提取物[2-4]，將“通陽(yáng)”藥物蔥白冷凍干燥后，通過超臨界二氧化碳萃取技術(shù)制備而成。該制劑(博心通軟膠囊)于2009年獲得湖北省藥監(jiān)局院內(nèi)制劑批號(hào)(鄂藥制字Z20093124Z)。在本院臨床廣泛應(yīng)用，在調(diào)節(jié)血脂方面療效顯著，本文擬利用基因芯片技術(shù)探討蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 16只雄性SPF級(jí)SD大鼠(180±20)g，購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，合格證號(hào)：42000600000069，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。隨機(jī)分為模型組、蔥白提取物組，每組8只。

1.1.2建立高脂血癥模型 采用邱服斌等[5]的方法用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)6周，確認(rèn)形成高脂血癥模型后再檢測(cè)其他相關(guān)指標(biāo)。高脂飼料配方：82.3%基礎(chǔ)飼料添加10%的豬油，2%膽固醇，5%蔗糖，0.5%脫氧膽酸鈉，0.2%甲硫氧嘧啶。由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)提供。

1.1.3藥物及給藥 蔥白提取物由武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑中心提供。根據(jù)人動(dòng)物換算劑量，蔥白提取物組給予42 mg/kg蔥白提取物灌胃，模型組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃，每天1次，均連續(xù)給藥6周。

1.1.4觀察指標(biāo) 利用基因芯片技術(shù)研究蔥白提取物對(duì)血脂的調(diào)控基因。

1.1.5儀器與試劑 OneArray?大鼠表達(dá)譜芯片(臺(tái)灣華聯(lián)生物科技，226-2013070101)；GCOS(數(shù)據(jù)處理軟件)；RNeasy Mini Kit(Qiagen 74104)；TRIzol Reagent(Invitrogen，5596-018)；RNAlater(Qiagen，76106)；One-Cycle cDNA Synthesis Kit(Affymetrix，900454)；GeneChip Eukaryotic(Affymetrix，900454)；β-Mercaptoethanol(Calbiochem，444203)

1.2方法

1.2.1提取純化總RNA及cDNA、標(biāo)記、雜交 用TRIzol按照試劑盒說明抽提總RNA并進(jìn)行濃度測(cè)定。純化采用QIAGEN RNeasy@Kit，純化后做進(jìn)一步的RNA質(zhì)量檢測(cè)。取2 μL Poly-A RNA Control Stock，稀釋，加入T7-(d7)24 primer 50 μmol/L，2 μL、 5×First strand cDNA buffer、SuperScript Ⅱ溫浴，離心，加 2 μL 10 U/μL T4 DNA 聚合酶，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)終止反應(yīng)。在合成的雙鏈 cDNA產(chǎn)物中加入 600 μL cDNA Binding Buffer，QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit 純化生物素標(biāo)記的cRNA。cRNA質(zhì)控用分光光度計(jì)分析。片斷化 cRNA，芯片使用前需平衡至室溫。確定芯片的類型(Standard Array)。在新的1.5 mL RNase-free離心管中配制雜交液。雜交液先99 ℃，5 min，然后45 ℃，5 min。在進(jìn)行上述步驟的同時(shí)通過加樣孔加入適量體積1×雜交緩沖液濕潤(rùn)芯片。雜交爐中45 ℃，60 rpm預(yù)雜交芯片10 min。從芯片中取出雜交緩沖液，加等體積處理好的雜交液。雜交爐中 45 ℃，60 rpm雜交芯片16 h。

1.2.2洗脫、染色、掃描芯片 洗脫、染色、掃描芯片之前都必須先定義一個(gè)Experiment。基因芯片洗滌工作站450用來洗脫和染色探針陣列。洗脫和染色、掃描。關(guān)閉洗滌工作站。

1.2.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 同一樣品雜交同一種類兩張芯片時(shí)，兩張芯片上除控制點(diǎn)以外，所有信號(hào)點(diǎn)的強(qiáng)度經(jīng)normalize以后的相關(guān)性大于95%。陣列圖像：陣列上沒有人為的痕跡，沒有大于芯片面積2.5%的刮痕。平均雜交背景信號(hào)值不大于100。B2寡核苷酸探針的特性描述如下：(1)在雜交矩陣的邊緣處亮度為交替出現(xiàn)型；(2)每個(gè)拐角處圖案為棋盤形圖案；(3)陣列的名稱位于陣列左上方

雜交控制：雜交信號(hào)中，BioB作為代表，其檢出率應(yīng)該至少有50%；BioC，BioD和cre的信號(hào)值應(yīng)比BioB的信號(hào)強(qiáng)。內(nèi)控制基因：rpt文件中所列的芯片上的看家基因(House keeping controls)，其中至少一個(gè)基因3′端的探針集合的雜交信號(hào)不能超過其5′端的探針集合的雜交信號(hào)的3倍(兩輪放大的除外)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證相關(guān)基因 Trizol提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系：GAPDH：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。Fgf21：第1個(gè)循環(huán) ：50 ℃ 2 min 95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)95 ℃ 30 s 60 ℃ 30 s，Scap：第1個(gè)循環(huán)50 ℃ 2 min 95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)95 ℃ 30 s 60 ℃ 30 s，熒光檢測(cè)，并繪制熔解曲線和擴(kuò)增曲線。驗(yàn)證基因及引物序列見表1。

1.3數(shù)據(jù)處理 首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和均一化處理。沒有重復(fù)的數(shù)據(jù)采用倍數(shù)法和Z值法相結(jié)合的方法來進(jìn)行差異基因的篩選，再對(duì)其他基因進(jìn)行差異表達(dá)篩選和聚類分析。用Gene Ontology(GO)功能分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類分析。用Pathway分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信號(hào)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1RNA質(zhì)量監(jiān)控 見表2。

2.2差異基因的篩選分析

2.2.1差異表達(dá)基因的聚類分析 模型組和蔥白提取物組基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)標(biāo)化后，根據(jù)差異倍數(shù)(fold change)篩選差異表達(dá)基因，選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)LOG2|差異倍數(shù)|≥1和P<0.05(2)LOG2比率=“NA”和樣品強(qiáng)度兩者之間的差異≥1 000；列出的蔥白提取物與模型組差異表達(dá)基因以≥Ratio值2倍標(biāo)準(zhǔn)篩選。篩選出表達(dá)上調(diào)2倍以上并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因59個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因16個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因43個(gè)。

表3 模型組和蔥白提取物組差異表達(dá)基因列表

續(xù)表3 模型組和蔥白提取物組差異表達(dá)基因列表

2.2.2差異表達(dá)基因的GO分析和Pathway分析 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋功能對(duì)差異性的表達(dá)基因進(jìn)行注釋及GO分析，對(duì)靶基因整合后進(jìn)行顯著性Pathway分析，結(jié)果顯示肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1B(carnitine palmitoyltransferase 1b，muscle，Cpt1b)、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡DNA片斷化因子a樣效應(yīng)因子A(cell death-inducing DFFA-like effector a，Cidea)、載脂蛋白2(lipocalin 2，Lcn2)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-coenzyme Adesaturase，Scd)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)gf21)等可能在蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂異常方面發(fā)揮了重要作用，蔥白調(diào)節(jié)血脂異常的導(dǎo)致差異表達(dá)的基因集中在能量代謝方面。而其他基因在血脂異常及其調(diào)節(jié)的研究方面罕見報(bào)道，也提示深入研究它們?cè)谘惓Ｖ械淖饔镁哂幸欢ǖ目臻g。

圖1 各組探針表達(dá)差異倍數(shù)統(tǒng)計(jì)圖

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 挑選相關(guān)基因Fgf21和非相關(guān)基因Scap去做RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明和芯片結(jié)果一致。

2.3.1各組大鼠肝組織Fgf21的表達(dá) 蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能與上調(diào)Fgf21的表達(dá)有關(guān)。

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內(nèi)參

圖2各組GAPDHRNA凝膠電泳圖

與模型組相比，蔥白提取物可以明顯上調(diào)Fgf21的表達(dá)(0.44±0.01vs. 0.65±0.01，P<0.05)，與基因芯片結(jié)果一致。

2.3.2各組大鼠肝組織Scap的表達(dá) 與模型組相比，蔥白提取物雖然可以減少Scap的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.70±0.15vs. 1.41±0.13)?；蛐酒Y(jié)果顯示蔥白提取物對(duì)Scap的表達(dá)影響不大，二者結(jié)果一致。蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能與減少Scap的表達(dá)關(guān)系不大。

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內(nèi)參

圖3各組Fgf21RNA凝膠電泳圖

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內(nèi)參

圖4各組ScapRNA凝膠電泳圖

與模型組相比，蔥白提取物雖然可以減少Scap的表達(dá)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.70±0.15vs. 1.41±0.13)。基因芯片結(jié)果顯示蔥白提取物對(duì)Scap的表達(dá)影響不大，二者結(jié)果一致。蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能與減少Scap的表達(dá)關(guān)系不大。

3 討 論

蔥白提取物與高脂血癥基因間存在著一定的關(guān)系，基因芯片為高通量篩選技術(shù)，可以將蔥白提取物和基因有效地結(jié)合起來，從而為探討蔥白提取物通過何種途徑發(fā)揮辛溫通陽(yáng)調(diào)節(jié)血脂代謝作用機(jī)制提供可能。

血脂是血清中的膽固醇、TG 和類脂(如磷脂)等的總稱，TG主要存在于人體的脂肪組織中，食物攝取的外源性TG經(jīng)胰脂肪酶水解后由腸道吸收，肝臟中內(nèi)源性TG的合成由底物供給(游離脂肪酸的可用性)、能量平衡(肝糖原的儲(chǔ)存水平)和激素狀態(tài)(胰島素與胰高血糖素之間的平衡)所調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示蔥白提取物調(diào)節(jié)TG主要通過以下幾個(gè)方面：一方面通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路影響脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)降低TG，如Cpt1b是長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的限速酶，Scd是催化飽和脂肪酸第9位碳鏈形成n-9系單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。Scd上升，抑制Cpt1b的活性，影響脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，使已進(jìn)入細(xì)胞的脂肪酸及其活化產(chǎn)物脂酰輔酶A沉積在胞質(zhì)內(nèi)，在線粒體的外膜外難以順暢地進(jìn)入線粒體基質(zhì)中進(jìn)行β氧化以實(shí)現(xiàn)最終的能量生成，從而加劇大量脂質(zhì)堆積。而蔥白提取物可以減少Scd的表達(dá)的同時(shí)，使Cpt1b的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及其活化產(chǎn)物脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體基質(zhì)中進(jìn)行β氧化，生成能量，減輕脂質(zhì)的沉積[6]。

另一方面通過影響脂肪轉(zhuǎn)化降低TG。Fgf21主要來源于肝臟，其過表達(dá)可促進(jìn)游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)轉(zhuǎn)化為酮體，三酰甘油水平下降[7]。脂肪組織按形態(tài)和功能分為兩種形式：白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)。WAT儲(chǔ)存能量，BAT則可加快體內(nèi)代謝，促進(jìn)能量消耗。Cidea 在棕色脂肪組織的線粒體中呈高表達(dá)，肥胖者脂肪組織中Cidea基因的mRNA表達(dá)水平降低，在體重減輕后可以恢復(fù)正常[8-9]。而在白色脂肪組織中Lcn2表達(dá)顯著增加，在前脂肪細(xì)胞分化成熟為脂肪細(xì)胞時(shí)Lcn2表達(dá)急劇增加[10-12]。而蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能與上調(diào)Fgf21、Cidea的表達(dá)，增加脂肪的利用、消耗及轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)下調(diào)Lcn2的表達(dá)減少前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，使脂肪貯存量下降，循環(huán)中的游離脂肪酸及甘油三酯減少[13]。

另外，本課題組前期數(shù)據(jù)挖掘[14-15]發(fā)現(xiàn)，蔥白提取物具有良好的辛溫通陽(yáng)作用和降低TG作用，而高脂血癥動(dòng)物模型中，筆者發(fā)現(xiàn)能量代謝相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，如Fgf21、Cpt1b、Cidea、Lcn2、Scd等基因的表達(dá)異常，而辛溫通陽(yáng)中藥蔥白提取物可以調(diào)節(jié)這種表達(dá)異常，說明辛溫通陽(yáng)的分子機(jī)制可能與能量代謝相關(guān)。

本研究采用高通量芯片技術(shù)對(duì)蔥白提取物辛溫通陽(yáng)作用及調(diào)血脂作用進(jìn)行評(píng)價(jià)?？紤]到數(shù)據(jù)有可能存在假陽(yáng)性，本課題組在后期進(jìn)行了特征基因的RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果具有一致性，證明本研究結(jié)果可靠。研究結(jié)果不僅揭示蔥白提取物調(diào)節(jié)血脂的作用機(jī)制可能與上調(diào)Fgf21、Cpt1b、Cidea，下調(diào)Lcn2、Scd基因的表達(dá)有關(guān)。而且提示了蔥白提取物辛溫通陽(yáng)作用與能量代謝之間的關(guān)系。這為后續(xù)探討蔥白提取物辛溫通陽(yáng)作用的分子機(jī)制提供了思路。