曹靜平，景春梅

[重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(重慶)/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地 400014]

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacten baumannii，Ab)是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛分布于水、土壤、人體皮膚及醫(yī)院環(huán)境[1]，常引起菌血癥、肺炎、腦膜炎、尿道感染、皮膚和傷口感染[2]。隨著碳青霉烯類(lèi)藥物的廣泛使用，出現(xiàn)了碳青酶烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAb)，給臨床抗感染治療帶來(lái)了較大的困難，對(duì)醫(yī)院感染的控制提出了新的要求。已經(jīng)證明耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌主要是產(chǎn)D類(lèi)碳青霉烯酶[3]，由 blaOXA-51-like,blaOXA-23-like,blaOXA-24-like,andblaOXA-58-like基因編碼。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 1 324株鮑曼不動(dòng)桿菌收集自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，其中重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)57株，新生兒病房60株，燒傷整形病房13株，呼吸病房10株，共分離非重復(fù)的CRAb 155株，其中來(lái)自痰液標(biāo)本136株，分泌物14株，膿液3株，灌洗液1株，導(dǎo)管1株。所有菌株均使用BD Phoenix自動(dòng)微生物系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。以大腸埃希菌ATCC25922及銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌。

1.2儀器與試劑 哥倫比亞血平板購(gòu)自重慶龐通公司，藥敏紙片購(gòu)自法國(guó)BioMerienx公司，Taq酶、PCR試劑購(gòu)自大連寶生生物公司，PTC-100型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購(gòu)自美國(guó)MJ-Research公司，TG16W微量高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，THZ-C恒溫振蕩器購(gòu)自江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，DYY-2C型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3藥物敏感性測(cè)試 用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果按“美國(guó)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)”判讀。

1.4模板DNA的制備 采用水煮法：取保存的鮑曼不動(dòng)桿菌接種至哥倫比亞血平板培養(yǎng)過(guò)夜，接種環(huán)挑取數(shù)個(gè)菌落于200 μL，煮沸10 min，14 000 r/min離心10 min，用于PCR的模板DNA的終濃度為50～100 ng/μL。

1.5PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄的碳青霉烯酶基因序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增OXA-23基因，OXA-24基因，OXA-51基因，OXA-58基因，VIM2基因、SIM1基因，blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游ISAba1啟動(dòng)元件引物序列，引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，包括10×緩沖液，0.75 μL MgCl2，1 μL dNTP，0.25 μL引物，1.25 U Taq酶以及1 μL DNA模板,其余為雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s。退火溫度55 ℃持續(xù)45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1．5%的瓊脂凝膠電泳5 V/cm共50 min，用溴乙錠染色后在紫外線下成像。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.6PCR產(chǎn)物的基因測(cè)序 對(duì)OXA-23基因，OXA-51基因，OXA-58基因，ISAba1基因的PCR純化產(chǎn)物送華大基因公司直接進(jìn)行基因測(cè)序，所測(cè)序列與GenBank上已收錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)以確定其基因型。

2 結(jié) 果

2.1菌株臨床資料 1 324株鮑曼不動(dòng)桿菌檢出碳青霉烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌155株(11.71%)，其中ICU 57株，新生兒病房60株，燒傷整形病房13株，呼吸病房10株，共分離非重復(fù)的CRAb 155株，其中來(lái)自痰液標(biāo)本136株，分泌物14株，膿液3株，灌洗液1株，導(dǎo)管1株。感染CRAb患兒年齡分布情況：28 d以?xún)?nèi)(新生兒)46株，28 d到1歲72株，1～2歲10株，2歲以上27株，見(jiàn)表2。

2.2CRAb耐藥情況 所有菌株除對(duì)多黏菌素敏感性最高，對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素(TE )、復(fù)方新諾明 (SXT)、氨芐西林/舒巴坦保持一定敏感性外，對(duì)其他耐藥率均已達(dá)100%。CRAb耐藥情況見(jiàn)表3。

表2 155株碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌科室分布情況(株)

表3 155株耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果[n(%)]

表4 122株碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因型分布情況(株)

2.3測(cè)序結(jié)果分析 隨機(jī)選取電泳結(jié)果陽(yáng)性的菌株，PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4電泳結(jié)果 見(jiàn)圖2。

2.5碳青霉烯酶及金屬酶的檢測(cè) B類(lèi)碳青霉烯酶基因VIM2、SIM1；D類(lèi)碳青霉烯酶基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58；擴(kuò)增blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游ISAba1啟動(dòng)元件檢出結(jié)果，見(jiàn)表4。

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

圖1測(cè)序結(jié)果

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

圖2電泳結(jié)果

3 討 論

從1985年被發(fā)現(xiàn)至今，CRAb的數(shù)量在世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，這表明鮑曼不動(dòng)桿菌具有對(duì)選擇性環(huán)境壓力作出快速反應(yīng)的能力[6]。本研究對(duì)155株兒童分離CRAb的藥物敏感測(cè)試結(jié)果顯示：與文獻(xiàn)報(bào)道的成人醫(yī)院分離的CRAb不同[7-12]，兒童分離菌株對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星以及左氧氟沙星保持較高的敏感率，并且與國(guó)內(nèi)其他省市兒童醫(yī)院分離的CRAb不同[13]。本地區(qū)兒童分離菌株對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明及氨芐西林/舒巴坦保持較高的敏感率，這可能與兒童及成人選藥類(lèi)型的不同而造成的藥物選擇壓力不同有關(guān)。不過(guò)，與成人分離菌株一致的是，這些菌株對(duì)慶大霉素、氨曲南、β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的敏感率均較低。鮑曼不動(dòng)桿菌抵抗環(huán)境改變的主要方式是上調(diào)內(nèi)源性耐藥機(jī)制及獲得外源性耐藥基因[7]。盡管鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥機(jī)制與外膜蛋白的改變，外排泵的作用及青霉素結(jié)合蛋白親和力的改變等非β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)機(jī)制也有關(guān)，但大量研究表明，碳青霉烯酶的產(chǎn)生是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)此類(lèi)抗生素耐藥最主要的機(jī)制[6]。OXA酶是鮑曼不動(dòng)桿菌中最早被發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶，它為質(zhì)?；蛉旧w所編碼，是引起全球范圍內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的主要酶類(lèi)。國(guó)內(nèi)目前浙江、北京、廣州、重慶等地區(qū)報(bào)道的CRAb產(chǎn)碳青霉烯酶類(lèi)型均為OXA-23酶。本研究發(fā)現(xiàn)：與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道的結(jié)果相似，OXA-23酶也是重慶地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌中最常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因型，122株CRAB中，78.69%的細(xì)菌均產(chǎn)生OXA-23型碳青霉烯酶，除此之外，OXA-51、OXA-58檢出率分別為65.57%、9.8%，并且OXA23/OXA51類(lèi)基因占57.38%、OXA-23/OXA-51/OXA-58占4.92%。在全球范圍內(nèi)，意大利首先于2006年6月報(bào)道在CRAb中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)OXA-58型鮑曼不動(dòng)桿菌[14]。同年11月比利時(shí)報(bào)道發(fā)現(xiàn)18株產(chǎn)OXA-58型鮑曼不動(dòng)桿菌[15]，2011年廣州市發(fā)現(xiàn)1株OXA-58型鮑曼不動(dòng)桿菌，因此本地區(qū)產(chǎn)OXA-58型CRAb的比例明顯高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)。本研究在122株耐藥菌株中未檢出OXA-24、VIM2、SIM1碳青霉烯酶基因，擴(kuò)增出OXA-51型碳青霉烯酶65.57%，在blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游連接有ISAba1啟動(dòng)元件(88.50%)，OXA-51-like基因天然存在于鮑曼不動(dòng)桿菌染色體上。TURTON等[16]報(bào)道，OXA-51-like酶顯示較弱碳青霉烯類(lèi)水解活性，但是如果其上游存在ISAba1插入序列，該序列可為OXA-51-like提供啟動(dòng)子，促進(jìn)其大量合成，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥。

綜上所述，本院兒童分離CRAb對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星及左氟沙星的敏感率顯著高于成人,并且對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明及氨芐西林/舒巴坦較國(guó)內(nèi)其他省市兒童醫(yī)院保持一定的敏感率。本地區(qū)流行的CRAb產(chǎn)OXA-23、OXA-51、OXA-58型碳青霉烯酶，且以O(shè)XA23/OXA51類(lèi)基因?yàn)橹?，在blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游連接有ISAba1啟動(dòng)元件。SAba1啟動(dòng)元件介導(dǎo)的OXA-23/OXA-51耐藥基因的水平傳播是導(dǎo)致本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類(lèi)耐藥性傳播的主要途徑。