馮 威，侯 昉，劉文英△，張利兵，陳文科，蔣 琴，賈紅慧

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院/四川省人民醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒外科，成都 610072;2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院小兒外科一病區(qū) 610074)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)是由于膈肌缺損，導(dǎo)致腹腔臟器、器官疝入胸腔，從而引起一系列病理生理變化的一種先天性疾病，在新生兒中的發(fā)病率為1∶2 500～1∶3 000[1]。盡管產(chǎn)前診斷及臨床手術(shù)治療的水平不斷提高，但根據(jù)全球多個醫(yī)療中心數(shù)據(jù)顯示，CDH病死率仍高達(dá)20%～60%[2]。迄今仍無有效治療手段從根本上改變CDH合并的肺發(fā)育不良和肺動脈高壓，這是其存活率不能改善的重要原因[3]。

國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)西地那非可以改善CDH患兒肺發(fā)育不良[4]，有利于CDH動物模型胎肺毛細(xì)血管新生及肺泡的發(fā)育[5]。實(shí)驗表明缺氧誘導(dǎo)因子-2α(HIF-2α)和血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)在胎肺發(fā)育過程中起著重要作用。因此本實(shí)驗擬通過對除草醚誘導(dǎo)的大鼠膈疝模型進(jìn)行產(chǎn)前西地那非干預(yù)，研究胎肺中HIF-2α、VEGF-A蛋白表達(dá)的變化情況，探討其改善肺發(fā)育不良可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物 成年Sprague-Dawley大鼠(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院/四川省人民醫(yī)院實(shí)驗動物研究所提供)：雌鼠20只，雄鼠10只，體質(zhì)量 220～300 g，平均(269.7±24.8)g，實(shí)驗前均未曾交配。

1.2儀器與試劑 除草醚(浙江化工二廠)、枸櫞酸西地那非片(美國輝瑞制藥有限公司)；VEGF-A蛋白兔多克隆抗體(英國Abcam公司)、HIF-2α蛋白兔多克隆抗體(英國Abcam公司)、GAPDH蛋白鼠單克隆抗體(美國Gene Tex公司)、ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)、二抗生物素化山羊抗兔、抗鼠IgG(英國Abcam公司)、Image Lab凝膠分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、ChemiDoc XRS+ Systems凝膠掃描成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型建立及分組 雌雄鼠按2∶1分籠，晚間定時配種，次日上午取雌鼠陰道分泌物涂片于顯微鏡下觀察，以發(fā)現(xiàn)精子為配種成功依據(jù)，確定為懷孕0.5 d。10只孕鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常空白組(NC組)2只；正常西地那非組(NS組)2只；模型空白組(MC組)3只；模型西地那非組(MS組)3只。孕9.5 d時，模型組6只孕鼠灌胃給予除草醚125 mg/只(溶于1 mL橄欖油)，正常組4只給予等量橄欖油。孕11.5～20.5 d，西地那非干預(yù)組5只孕鼠每天灌胃西地那非8 mg/只(溶于2 mL生理鹽水中)，空白組5只大鼠每天給予等量生理鹽水。

1.3.2肺組織標(biāo)本采集 孕21 d,所有孕鼠行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后剖宮取出胎鼠，稱量胎鼠體質(zhì)量(Bw)后斷頭處死，經(jīng)胸骨正中切口剖開胸腔，完整取出兩側(cè)肺組織并稱質(zhì)量(Lw)，將胎肺組織從支氣管分叉處分成左右兩肺，各取部分肺組織即刻放入10%中性甲醛和-70 ℃低溫環(huán)境保存?zhèn)溆?。將去除肺組織的胎鼠置于(4倍)放大鏡下,經(jīng)頭側(cè)仔細(xì)觀察有無膈肌缺損,逐一記錄有無膈疝、膈疝的位置、膈肌缺損的大小及疝內(nèi)容物，分析比較各組胎鼠肺發(fā)育情況。

1.3.3肺組織形態(tài)學(xué)觀察 將固定于10%甲醛中的肺組織于24 h內(nèi)石蠟包埋，行常規(guī)切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，在Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察，BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)圖像采集，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量以下肺實(shí)質(zhì)、血管的發(fā)育情況。(1)平均終末支氣管密度(MTBD)：100倍視野下計數(shù)10個互不重疊視野內(nèi)終末支氣管個數(shù)。終末支氣管的數(shù)目與環(huán)繞每個終末支氣管的腺泡數(shù)成反比，因此肺組織結(jié)構(gòu)越成熟，MTBD越小[6]。(2)肺泡間隔：200倍視野下測量互不重疊的3個視野下10～15個肺泡間隔的厚度。(3)平均肺泡面積：200倍視野下測量互不重疊的5個視野內(nèi)10～15個肺泡的平均面積。(4)肺泡面積百分比(PAA%)：200倍視野下測量互不重疊的5個視野內(nèi)的肺泡面積比。(5)小血管個數(shù)：200倍視野下計數(shù)5個互不重疊視野內(nèi)直徑30～70 μm的血管個數(shù)。(6)血管中膜厚度(medial wall thickness，MWT):200倍視野下每張切片測量至少3根含有平滑肌層、形態(tài)規(guī)則的直徑小于70 μm肺小動脈的如下指標(biāo)，血管外徑(external diameter，ED)、血管內(nèi)徑(internal diameter，ID)，MWT=(ED-ID)/2,MWT是評估肺血管重構(gòu)情況的指標(biāo)[7]。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色 每組隨機(jī)選擇8個樣本采用SP法分別檢測HIF-2α、VEGF-A蛋白在胎肺組織中的表達(dá)，以PBS(pH 7.2～7.4)替代一抗作為空白對照，以染色呈淺黃色或棕黃色為陽性，藍(lán)色為陰性。BA200Digital數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)采集肺組織圖像，在400倍視野下選取2個互不重疊的視野，并使用Image-Pro Plus6.0軟件分析測定陽性染色顆粒的平均光密度(AOD)。

1.3.5Western blot 各組取等重量的冰凍組織解凍后用勻漿器研磨均勻，加入細(xì)胞裂解液，按照BCA Protein Assay Kit 說明書提取各組肺組織蛋白并測定蛋白濃度，按每孔蛋白量100 μg上樣后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，將PVDF膜放入稀釋的TBST封閉液中2 h,洗膜后加入一抗(HIF-2α蛋白抗體1∶500稀釋；VEGF-A蛋白抗體1∶500稀釋，內(nèi)參GAPDH蛋白抗體1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，再次洗膜后加入二抗(山羊抗兔、抗鼠IgG 1∶5 000稀釋)孵育2 h,洗膜后顯影、定影、拍照，Image Lab系統(tǒng)分析各組蛋白條帶表達(dá)量并計算相對灰度值(目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗動物一般情況及胎肺的觀察 10只孕鼠共收獲胎鼠113只，其中NC組27只，NS組19只，均無膈疝形成；MC組收獲胎鼠38只，膈疝致畸率為60.53%(23/38)，MS組收獲胎鼠29只，膈疝致畸率為72.41%(21/29)，疝內(nèi)容物主要為肝、胃及小腸等，兩組致畸率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MC組Lw/Bw較NC組顯著降低(P<0.01)，MS組與MC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.76)，NS組與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.19)，見表1。

表1 模型誘導(dǎo)情況及肺組織觀察

*:P<0.01,與NC組比較

2.2組織形態(tài)學(xué)檢查 各組肺組織發(fā)育情況見圖1，對各項測得的觀察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與NC組相比較，MC組胎肺中MTBD、肺泡間隔及MWT均顯著升高(P<0.01)，平均肺泡面積、PAA%、小血管個數(shù)、血管內(nèi)徑均減小(P<0.01)；與NC組比較，MS組MTBD、肺泡間隔及MWT均降低(P<0.01)，平均肺泡面積增大(P<0.05)，小血管個數(shù)顯著增多、血管管腔增大(P<0.01)；NS組相比于NC組除小血管個數(shù)有所減少(P<0.05)，其余指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2、表3。

2.3免疫組織化學(xué)染色圖像分析 HIF-2α陽性染色主要位于肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核及支氣管上皮細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞膜，而在血管組織細(xì)胞中表達(dá)較少(圖2)；VEGF-A則廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞，見圖3。HIF-2α蛋白與VEGF-A蛋白陽性表達(dá)平均光密度呈正相關(guān)(r=0.463，P<0.01)。

表2 各組肺泡及支氣管發(fā)育指標(biāo)檢測

*：P<0.05、**：P<0.01，與NC組比較；#：P<0.05、##：P<0.01，與MC組比較

表3 各組肺小血管發(fā)育指標(biāo)檢測

*：P<0.05、**：P<0.01，與NC組比較；#：P<0.05、##：P<0.01，與MC組比較

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖1肺組織切片形態(tài)學(xué)觀察(HE×100)

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖2胎肺組織HIF-2α免疫組織化學(xué)染色光鏡觀察(×200)

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖3胎肺組織VEGF-A免疫組織化學(xué)染色光鏡觀察(×200)

圖4 HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎肺組織中的表達(dá)情況

**:P<0.01

圖5 HIF-2α蛋白在各組胎肺中表達(dá)情況比較

2.4Western blot 定量檢測HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達(dá)情況 HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎鼠肺組織中表達(dá)情況見圖4。MC組HIF-2α相對表達(dá)水平(0.557±0.383)與NC組(1.474±0.305)和MS組(1.195±0.035)相比均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組與NS組(0.970±0.288)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.076)；VEGF-A在NC組和MS組中相對表達(dá)水平分別為(1.026±0.156)和(1.019±0.157)，與MC組(0.646±0.026)相比均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NC組和NS組(0.885±0.294)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.374)，見圖5、6。

*:P<0.05

圖6 VEGF-A蛋白在各組胎肺中表達(dá)情況比較

3 討 論

肺動脈高壓合并肺發(fā)育不良是CHD最主要的病理特征，本研究通過在顯微鏡下對比CDH模型胎鼠與正常胎鼠肺組織發(fā)育情況證實(shí)了以上觀點(diǎn)，即模型組胎肺肺泡塌陷不均勻，有效通氣面積大幅減小，肺泡間隔增厚，終末支氣管增多，肺細(xì)小血管數(shù)量顯著減少，血管病理性重構(gòu)明顯，管徑減小，管壁增粗，存在明顯肺發(fā)育不良及肺動脈高壓的表現(xiàn)。

西地那非是磷酸二酯酶-5(PDE5)的選擇性抑制劑，最早研究用于心絞痛的治療，其后由于意外發(fā)現(xiàn)的血管舒張作用有治療陰莖勃起不良(erection dysfunction,ED)的特效而被人們所熟知，其可在神經(jīng)末梢和內(nèi)皮細(xì)胞釋放出的NO與平滑肌受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，并在錳離子(Mn2+)參與下促進(jìn)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)生成,cGMP通過活化鈣離子(Ca2+)泵使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，從而使血管舒張，血流增多。已經(jīng)證實(shí)西地那非的作用機(jī)制正是通過選擇性抑制PDE5對 cGMP的降解作用，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，增強(qiáng)NO的舒張血管作用[8]。后來研究者發(fā)現(xiàn)西地那非同樣能作用于肺血管舒張而有效地緩解肺動脈高壓，并且合適的治療劑量不會對其他系統(tǒng)造成明顯的不良反應(yīng)[9]，現(xiàn)已成為臨床上治療肺動脈高壓的可選擇藥物[10]。近年來，國外研究者們將西地那非用于治療CHD的研究中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前西地那非干預(yù)能緩解肺動脈高壓[3],對CDH肺血管的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用[11]，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)西地那非產(chǎn)前干預(yù)并沒有降低CDH的發(fā)生率，但通過產(chǎn)前西地那非干預(yù)的胎鼠肺泡平均面積增大，間隔變薄，終末支氣管明顯減少，肺泡間微小血管數(shù)量增多，血管腔增大，管壁明顯變薄，較CDH模型小鼠胎肺發(fā)育明顯改善，提示西地那非對胎肺成熟和緩解肺動脈高壓有明顯的促進(jìn)作用，而對正常孕鼠進(jìn)行西地那非干預(yù)后觀察到，除對肺血管有一定的舒張作用外，對胎鼠胎肺的發(fā)育沒有產(chǎn)生明顯的影響。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子參與了胎肺的發(fā)育過程，其中HIF-2α和VEGF-A的表達(dá)可能在肺血管重構(gòu)、新生血管形成及肺泡、細(xì)小支氣管的發(fā)育過程中起著重要的作用[12-13]。HIF是細(xì)胞對低氧環(huán)境反應(yīng)的重要的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)在HIF-2α基因缺失的小鼠中VEGF-A表達(dá)明顯降低并且引發(fā)了嚴(yán)重的肺發(fā)育不良[14],GIATROMANOLAKI等[15]在對皮膚血管瘤的研究中發(fā)現(xiàn)HIF-2α異常升高可以上調(diào)VEGF-A的表達(dá)從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速增殖，促進(jìn)了血管的快速生成。HUANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在胎鼠胚胎發(fā)育末期表達(dá)顯著增高有利于肺泡Ⅱ型細(xì)胞分泌表面活性物質(zhì)，降低肺泡表面張力，促進(jìn)肺泡成熟。眾所周知，VEGF在血管發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，許多研究發(fā)現(xiàn)，VEGF作為多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的下游調(diào)節(jié)靶向基因，直接參與了肺血管的增殖和分化。然而VEGF家族成員眾多，且在不同疾病的組織中表達(dá)的特點(diǎn)各不相同，有研究發(fā)現(xiàn)在除草醚誘導(dǎo)的CDH動物模型胎肺中VEGF-A mRNA呈低表達(dá)[17],陳中獻(xiàn)等[18]也在研究漢防己甲素干預(yù)對CDH胎肺發(fā)育影響中發(fā)現(xiàn)TET通過上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)促進(jìn)肺泡周圍毛細(xì)血管發(fā)育;然而SHEHATA等[19]在對死于嚴(yán)重的CHD肺動脈高壓的新生兒肺的研究中發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)卻異常增高，OUE等[20]也在除草醚誘導(dǎo)的CHD胎鼠模型中發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)有升高。因此VEGF在CHD肺發(fā)育過程中表達(dá)尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HIF-2α、VEGF-A蛋白在肺泡、細(xì)支氣管、微血管上均有不同程度的表達(dá)，且在膈疝MC組中表達(dá)明顯弱于NC組，結(jié)合肺組織形態(tài)學(xué)觀察可以說明，HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達(dá)異常降低與肺發(fā)育不良和肺動脈高壓的形成有密切的關(guān)系，而通過西地那非干預(yù)后，其陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，并且兩因子表達(dá)變化趨勢呈正相關(guān)。隨后應(yīng)用Western blot技術(shù)對HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎肺中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測，其結(jié)果與免疫組織化學(xué)觀察到的表達(dá)變化趨勢基本一致，即與NC組相比，HIF-2α、VEGF-A蛋白在MC組中表達(dá)明顯降低；而在MS組中表達(dá)則高于MC組。因此本組實(shí)驗研究提示，對除草醚誘導(dǎo)的大鼠CDH模型產(chǎn)前使用西地那非進(jìn)行干預(yù)，可以促進(jìn)肺泡發(fā)育和血管新生，改善肺組織結(jié)構(gòu)，緩解肺動脈高壓，推測可能是通過上調(diào)HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，由于在低氧條件下HIF-2α蛋白是VEGF-A的上游誘生因子，因此西地那非也可能在缺氧環(huán)境下發(fā)育不良的肺內(nèi)通過增強(qiáng)HIF-2α蛋白表達(dá)來上調(diào)VEGF-A蛋白表達(dá)，VEGF-A蛋白作用于肺血管促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，誘發(fā)更多的血管新生，減小血管中膜厚度，維持血管正常的完整形態(tài)，增強(qiáng)了血管通透性，而肺內(nèi)血流循環(huán)的改善促進(jìn)了肺泡的發(fā)育[21]；另一方面 HIF-2α蛋白也可直接作用于肺泡上皮細(xì)胞，促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌肺表面活性物質(zhì)，減少肺表面張力，有利于肺泡發(fā)育成熟[16]。

綜上所述，本實(shí)驗證實(shí)了西地那非對改善CHD組織發(fā)育的具有促進(jìn)作用，并推測西地那非可能通過直接或間接地上調(diào)HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達(dá)來協(xié)同促進(jìn)肺小血管及肺泡的成熟。然而西地那非具體是如何作用于其靶向調(diào)節(jié)基因還不明確，國外文獻(xiàn)報道可能有更多的細(xì)胞因子參與了西地那非的調(diào)節(jié)機(jī)制[22-23]，因此還需要更加深入的研究明確。