周麗春,朱建忠,王文廣,蔡 謹(jǐn),黃 磊,徐志南*
(1.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州310027;2.杭州貝谷生物科技有限公司,浙江 杭州310013)
丁酸作為一種極為重要的大宗化學(xué)品已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)[1]。在飼料行業(yè),丁酸是一種生物調(diào)節(jié)劑,可以作為腸道細(xì)胞的能量來源,調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群和促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收等[2]。因?yàn)橛坞x性丁酸容易揮發(fā),在飼料生產(chǎn)中通常將其制成相對(duì)穩(wěn)定的鈉鹽——丁酸鈉。丁酸鈉無(wú)污染、無(wú)有害殘留,具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)生理功能,正逐漸成為熱門的抗生素替代品之一[3]。
丁酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。目前,丁酸工業(yè)生產(chǎn)采用化學(xué)合成法。生物發(fā)酵法仍然無(wú)法與化學(xué)合成法競(jìng)爭(zhēng),其主要原因是:發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)物分離難,生產(chǎn)成本高[4-5]。因此,開發(fā)一種更為簡(jiǎn)便有效、成本低廉的發(fā)酵形式至關(guān)重要。美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)出纖維床生物反應(yīng)器(Fibrous-Bed Bioreactor,F(xiàn)BB), 使得固定化載體上一直保持較高的活細(xì)胞密度,提高了發(fā)酵產(chǎn)物的終產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)率等,已應(yīng)用于乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等多種有機(jī)酸發(fā)酵[6-9]。但該反應(yīng)器的固定床制作成本較高,且難以工業(yè)放大。
米糠作為稻谷加工的副產(chǎn)物,資源豐富,且價(jià)格低廉[10]。在飼料加工中,米糠是一種常用的飼料添加劑載體。同時(shí),米糠也是一種纖維素材料,可用于細(xì)胞固定化。
本研究首次提出將低廉的米糠作為固定化載體,構(gòu)建了一種外置式纖維床反應(yīng)器(external fibrous-bed bioreactor)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸,發(fā)酵后直接將吸附了產(chǎn)物——丁酸鈉的米糠用作飼料添加劑。以簡(jiǎn)化原有的提取丁酸,再添加到飼料制備過程中。開拓一條綜合利用飼料原料,高效、廉價(jià)生產(chǎn)飼料添加劑——丁酸鈉的新思路。
酪丁酸梭菌 (Clostridium tyrobutyricumATCC 25755),由浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。
種子培養(yǎng)基(g/L):胰酪胨5,酵母粉 5,氯化鈉4.18,葡萄糖 30,痕量金屬溶液 10 mL,0.2%FeSO4·7H2O溶液2 mL。pH 6.0,沸水浴加熱除氧。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):胰酪胨5,酵母粉 5,氯化鈉4.18,葡萄糖50,痕量金屬溶液10 mL。
痕量金屬溶液 (g/L):MnSO4·2H2O 0.5,CoCl20.1,CaCl2·2H2O 0.1,ZnSO4·5H2O 0.1,CuSO4·5H2O 0.1,KAl (SO4)20.01,H3BO40.01,Na2MoO4·3H2O 0.01。
將保藏的菌種以5%的接種量接種于含40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中,于YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)中37℃厭氧培養(yǎng)48 h,制成一級(jí)種子液。以5%的接種量繼續(xù)傳代,得到二級(jí)種子液。
在5 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐 (上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中進(jìn)行游離細(xì)胞發(fā)酵。2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中接入100 mL二級(jí)種子液,37℃,150 r/min條件下發(fā)酵,通入氮?dú)庖员WC反應(yīng)器中的厭氧環(huán)境,利用6 mol/L NaOH控制發(fā)酵液pH值6.0。
玻璃固定化柱(柱長(zhǎng):31 cm;內(nèi)部直徑:5 cm)帶有夾套,裝填80 g洗凈、烘干至恒重的米糠,兩端采用不銹鋼絲網(wǎng)固定,玻璃柱底部填充高約 15~30 mm的玻璃彈簧,其工作體積約為500 mL。將發(fā)酵罐與玻璃固定化柱分別滅菌,利用蠕動(dòng)泵將二者相連接,采用循環(huán)恒溫水浴鍋控制固定化柱溫度,構(gòu)建為外置式纖維床反應(yīng)器(見圖1)。
發(fā)酵操作同游離細(xì)胞發(fā)酵,待發(fā)酵罐中OD600值達(dá)到6.0時(shí)即開啟纖維床生物反應(yīng)器,初始循環(huán)速度為30 mL/min,維持循環(huán) 36~48 h,進(jìn)行菌體固定化培養(yǎng),至發(fā)酵罐內(nèi)的游離菌體濃度不再降低,取出所有的發(fā)酵液并更換新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基 (2 L體系),提高泵的轉(zhuǎn)速至100 mL/min,開始進(jìn)行固定化發(fā)酵。
1.6.1 米糠吸附丁酸鈉模擬實(shí)驗(yàn)移取50 mL濃度為30 g/L丁酸鈉溶液于250 mL錐形瓶中,調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0,投加8.0 g的米糠,置于37℃搖床中進(jìn)行振蕩吸附反應(yīng)(150 r/min),在時(shí)間為0.5、1、2、4、8、10 和 24 h 時(shí)后取出溶液并測(cè)定丁酸鈉的濃度。同時(shí)設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)和空白實(shí)驗(yàn)。
式中:q為米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù),g/g;c0為空白對(duì)照丁酸鈉質(zhì)量濃度,g/L;ct為剩余丁酸鈉質(zhì)量濃度,g/L;v為溶液體積,L;m為米糠投加量,g。
1.6.2 固定化發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的測(cè)定用1%的磷酸溶液洗滌米糠,直至洗下溶液中丁酸鈉質(zhì)量濃度為0 g/L,定容后測(cè)洗下溶液的丁酸鈉含量。將米糠在80℃烘箱中烘干至恒重,測(cè)定其質(zhì)量M。吸附量為
式中:Q為發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù),g/g;C為洗下溶液中丁酸鈉的質(zhì)量濃度,g/L;V為定容后的溶液體積,L;M為米糠的質(zhì)量,g。
1.7.1 菌體含量測(cè)定游離細(xì)胞生物量的測(cè)定:采用紫外/可見光分光光度計(jì)于600 nm讀取菌懸液的OD600。
固定化細(xì)胞生物量(m1)的測(cè)定:發(fā)酵前測(cè)定固定化所用米糠的干重(m2),發(fā)酵后取出固定化菌體后的米糠,在在80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重(m3)。固定化細(xì)胞生物量為(m1=m3-m2)。
1.7.2 葡萄糖含量測(cè)定采用SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定葡萄糖的含量。
1.7.3 丁酸和乙酸含量測(cè)定采用安捷倫6820型氣相色譜系統(tǒng)檢測(cè),以內(nèi)標(biāo)法定量分析發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度。檢測(cè)所用檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器,色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱 (30 m×0.32 mm),流動(dòng)相為高純氮?dú)?,流速? mL/min。測(cè)定條件:柱溫250℃,進(jìn)樣口溫度250℃。發(fā)酵液10 000 r/min離心后取上清液1 mL,加入內(nèi)標(biāo)物丙酸 30 μL,進(jìn)樣量 0.4 μL。
進(jìn)行了游離細(xì)胞和外置式纖維床反應(yīng)器固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的比較,結(jié)果如圖2所示。在游離發(fā)酵模式中,50 g/L的葡萄糖在64 h后被完全消耗,丁酸最終產(chǎn)量為19.84 g/L,生產(chǎn)率為0.31 g/L/h。而固定化細(xì)胞發(fā)酵模式中的葡萄糖在48 h后被完全消耗,丁酸最終產(chǎn)量達(dá)到22.85 g/L,生產(chǎn)率達(dá)到0.48 g/L/h,比游離發(fā)酵分別提高了15%和55%。同時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率與游離細(xì)胞發(fā)酵相比提高了13%(0.46 g/g vs.0.40 g/g),發(fā)酵時(shí)間從 64 h 縮短到48 h。因此,外置式纖維床固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸比游離發(fā)酵具有明顯的優(yōu)勢(shì)。從圖2中可以看出,固定化細(xì)胞分批發(fā)酵模式可以縮短菌體的遲滯期。這一研究結(jié)果與其他類似的纖維床反應(yīng)器發(fā)酵的結(jié)果基本一致[11-12]。
圖2 游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.2 Batch fermentation for butyric acid production with free-cell and immobilized-cell
如圖3所示,初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L,所有的葡萄糖(135 g/L)在165 h后被消耗完,共產(chǎn)生30.69 g/L的丁酸。糖消耗速率和丁酸生產(chǎn)速率在每次補(bǔ)料后都有所降低,這是由于隨著丁酸濃度的增加,產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制,這與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)[11]發(fā)酵結(jié)果表明固定化補(bǔ)料分批模式有利于提高丁酸的產(chǎn)量,而本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)料分批模式未見丁酸產(chǎn)量有明顯提高,因此推測(cè)作為固定化介質(zhì)的米糠對(duì)發(fā)酵液中的丁酸鈉存在吸附作用。
圖3 固定化細(xì)胞補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.3 Fed-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell
2.3.1 米糠對(duì)丁酸鈉吸附的模擬實(shí)驗(yàn)在與發(fā)酵條件基本一致的情況下 (丁酸鈉30 g/L,pH 6.0,溫度37℃)進(jìn)行了米糠對(duì)丁酸鈉的吸附模擬實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,最后達(dá)到吸附平衡。吸附開始的前8 h,吸附量增加迅速,8 h后,吸附量增加緩慢并逐漸趨向吸附平衡,最終平衡吸附量可以達(dá)到0.084 g/g。
圖4 米糠對(duì)丁酸鈉的吸附Fig.4 Adsorption of sodium butyrate by rice bran
2.3.2 固定化發(fā)酵后的米糠對(duì)丁酸鈉的吸附將固定化補(bǔ)料分批發(fā)酵后的米糠取出烘干后,對(duì)其上吸附的丁酸鈉和酪丁酸梭菌的量進(jìn)行了測(cè)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得,作為固定化介質(zhì)后的米糠對(duì)酪丁酸梭菌的吸附量為0.106 g/g,對(duì)丁酸鈉的吸附量為0.105 g/g。固定化發(fā)酵后的米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量略高于模擬實(shí)驗(yàn)中米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量,這可能是由于在固定化發(fā)酵的長(zhǎng)期過程中,米糠的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化,提高了米糠對(duì)丁酸鈉的吸附效率,此外,米糠會(huì)吸附酪丁酸梭菌,菌體中含有的丁酸鈉也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在飼料添加中,丁酸鈉的添加量通常為0.2~3 kg/t,米糠的添加量通常為50 kg/t,二者的添加比例為0.004~0.06 g/g。固定化后的米糠經(jīng)適當(dāng)稀釋后可保持與飼料添加中米糠和丁酸鈉的添加比例一致,這一發(fā)酵模式可為飼料添加提供參考。在飼料添加中,可以利用米糠作為固定化載體,發(fā)酵生產(chǎn)丁酸,待發(fā)酵結(jié)束后直接將米糠投加到飼料中,米糠所吸附的丁酸鈉可以滿足動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。同時(shí)米糠吸附的酪丁酸梭菌作為益生菌有著優(yōu)異的益生、防病作用,在替代抗生素、防治疾病和改善環(huán)境方面起到了很好的作用[13]。
為了觀察外置式纖維床反應(yīng)器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性能,采用了固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。在重復(fù)8次固定化分批發(fā)酵中,菌體的生長(zhǎng)過程幾乎沒有遲滯期,底物消耗速度都很快。每次更換新鮮培養(yǎng)基時(shí),菌體的生長(zhǎng)均未出現(xiàn)遲滯期,表明固定在米糠纖維床反應(yīng)器內(nèi)的菌體具有較高的活性且穩(wěn)定。所有批次中的丁酸質(zhì)量濃度在19.03 g/L到22.58 g/L間,平均值為21.05 g/L。丁酸生產(chǎn)率從0.36 g/L/h到0.45 g/L/h不等,平均值為0.40 g/L/h。文獻(xiàn)[14]利用菊芋水解液重復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)丁酸,10個(gè)批次的丁酸產(chǎn)量保持穩(wěn)定,本文的研究結(jié)果與其一致。
圖5 固定化細(xì)胞重復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.5 Repeated-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell
1)本研究構(gòu)建了一種新型的外置式纖維床生物反應(yīng)器用于酪丁酸梭菌固定化分批發(fā)酵丁酸,丁酸的生產(chǎn)率比游離發(fā)酵提高了55%。
2)米糠在發(fā)酵過程中吸附丁酸鈉的量與常規(guī)飼料中丁酸鈉的添加量基本一致,因此可以作為一種簡(jiǎn)便快速的飼料添加新方式。
3)在固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式中,得到丁酸的平均濃度為21.05 g/L,外置式纖維床反應(yīng)器展現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性。這對(duì)于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)丁酸及丁酸鈉在飼料中的添加新途徑具有一定的指導(dǎo)意義。