周麗春，朱建忠，王文廣，蔡 謹(jǐn)，黃 磊，徐志南*

（1．浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州310027；2．杭州貝谷生物科技有限公司，浙江 杭州310013）

丁酸作為一種極為重要的大宗化學(xué)品已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)[1]。在飼料行業(yè)，丁酸是一種生物調(diào)節(jié)劑，可以作為腸道細(xì)胞的能量來源，調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群和促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收等[2]。因?yàn)橛坞x性丁酸容易揮發(fā)，在飼料生產(chǎn)中通常將其制成相對(duì)穩(wěn)定的鈉鹽——丁酸鈉。丁酸鈉無(wú)污染、無(wú)有害殘留，具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)生理功能，正逐漸成為熱門的抗生素替代品之一[3]。

丁酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。目前，丁酸工業(yè)生產(chǎn)采用化學(xué)合成法。生物發(fā)酵法仍然無(wú)法與化學(xué)合成法競(jìng)爭(zhēng)，其主要原因是：發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)物分離難，生產(chǎn)成本高[4-5]。因此，開發(fā)一種更為簡(jiǎn)便有效、成本低廉的發(fā)酵形式至關(guān)重要。美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出纖維床生物反應(yīng)器（Fibrous-Bed Bioreactor，F(xiàn)BB）， 使得固定化載體上一直保持較高的活細(xì)胞密度，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的終產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)率等，已應(yīng)用于乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等多種有機(jī)酸發(fā)酵[6-9]。但該反應(yīng)器的固定床制作成本較高，且難以工業(yè)放大。

米糠作為稻谷加工的副產(chǎn)物，資源豐富，且價(jià)格低廉[10]。在飼料加工中，米糠是一種常用的飼料添加劑載體。同時(shí)，米糠也是一種纖維素材料，可用于細(xì)胞固定化。

本研究首次提出將低廉的米糠作為固定化載體，構(gòu)建了一種外置式纖維床反應(yīng)器（external fibrous-bed bioreactor）發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，發(fā)酵后直接將吸附了產(chǎn)物——丁酸鈉的米糠用作飼料添加劑。以簡(jiǎn)化原有的提取丁酸，再添加到飼料制備過程中。開拓一條綜合利用飼料原料，高效、廉價(jià)生產(chǎn)飼料添加劑——丁酸鈉的新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

酪丁酸梭菌 （Clostridium tyrobutyricumATCC 25755），由浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰酪胨5，酵母粉 5，氯化鈉4.18，葡萄糖 30，痕量金屬溶液 10 mL，0.2%FeSO4·7H2O溶液2 mL。pH 6.0，沸水浴加熱除氧。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：胰酪胨5，酵母粉 5，氯化鈉4.18，葡萄糖50，痕量金屬溶液10 mL。

痕量金屬溶液 （g/L）：MnSO4·2H2O 0.5，CoCl20.1，CaCl2·2H2O 0.1，ZnSO4·5H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，KAl （SO4）20.01，H3BO40.01，Na2MoO4·3H2O 0.01。

1.2 種子液制備

將保藏的菌種以5%的接種量接種于含40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中，于YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）中37℃厭氧培養(yǎng)48 h，制成一級(jí)種子液。以5%的接種量繼續(xù)傳代，得到二級(jí)種子液。

1.3 游離細(xì)胞發(fā)酵

在5 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐 （上海保興生物設(shè)備工程有限公司）中進(jìn)行游離細(xì)胞發(fā)酵。2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中接入100 mL二級(jí)種子液，37℃，150 r/min條件下發(fā)酵，通入氮?dú)庖员ＷC反應(yīng)器中的厭氧環(huán)境，利用6 mol/L NaOH控制發(fā)酵液pH值6.0。

1.4 外置式纖維床反應(yīng)器構(gòu)建

玻璃固定化柱（柱長(zhǎng)：31 cm；內(nèi)部直徑：5 cm）帶有夾套，裝填80 g洗凈、烘干至恒重的米糠，兩端采用不銹鋼絲網(wǎng)固定，玻璃柱底部填充高約 15～30 mm的玻璃彈簧，其工作體積約為500 mL。將發(fā)酵罐與玻璃固定化柱分別滅菌，利用蠕動(dòng)泵將二者相連接，采用循環(huán)恒溫水浴鍋控制固定化柱溫度，構(gòu)建為外置式纖維床反應(yīng)器（見圖1）。

1.5 固定化細(xì)胞發(fā)酵

發(fā)酵操作同游離細(xì)胞發(fā)酵，待發(fā)酵罐中OD600值達(dá)到6.0時(shí)即開啟纖維床生物反應(yīng)器，初始循環(huán)速度為30 mL/min，維持循環(huán) 36～48 h，進(jìn)行菌體固定化培養(yǎng)，至發(fā)酵罐內(nèi)的游離菌體濃度不再降低，取出所有的發(fā)酵液并更換新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基 （2 L體系），提高泵的轉(zhuǎn)速至100 mL/min，開始進(jìn)行固定化發(fā)酵。

1.6 米糠對(duì)丁酸鈉的吸附實(shí)驗(yàn)

1.6.1 米糠吸附丁酸鈉模擬實(shí)驗(yàn)移取50 mL濃度為30 g/L丁酸鈉溶液于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，投加8.0 g的米糠，置于37℃搖床中進(jìn)行振蕩吸附反應(yīng)（150 r/min），在時(shí)間為0.5、1、2、4、8、10 和 24 h 時(shí)后取出溶液并測(cè)定丁酸鈉的濃度。同時(shí)設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)和空白實(shí)驗(yàn)。

式中：q為米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g；c0為空白對(duì)照丁酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；ct為剩余丁酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；v為溶液體積，L；m為米糠投加量，g。

1.6.2 固定化發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的測(cè)定用1%的磷酸溶液洗滌米糠，直至洗下溶液中丁酸鈉質(zhì)量濃度為0 g/L，定容后測(cè)洗下溶液的丁酸鈉含量。將米糠在80℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)定其質(zhì)量M。吸附量為

式中：Q為發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g；C為洗下溶液中丁酸鈉的質(zhì)量濃度，g/L；V為定容后的溶液體積，L；M為米糠的質(zhì)量，g。

1.7 分析方法

1.7.1 菌體含量測(cè)定游離細(xì)胞生物量的測(cè)定：采用紫外/可見光分光光度計(jì)于600 nm讀取菌懸液的OD600。

固定化細(xì)胞生物量（m1）的測(cè)定：發(fā)酵前測(cè)定固定化所用米糠的干重（m2），發(fā)酵后取出固定化菌體后的米糠，在在80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重（m3）。固定化細(xì)胞生物量為（m1=m3-m2）。

1.7.2 葡萄糖含量測(cè)定采用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測(cè)定葡萄糖的含量。

1.7.3 丁酸和乙酸含量測(cè)定采用安捷倫6820型氣相色譜系統(tǒng)檢測(cè)，以內(nèi)標(biāo)法定量分析發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度。檢測(cè)所用檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱 （30 m×0.32 mm），流動(dòng)相為高純氮?dú)?，流速? mL/min。測(cè)定條件：柱溫250℃，進(jìn)樣口溫度250℃。發(fā)酵液10 000 r/min離心后取上清液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)物丙酸 30 μL，進(jìn)樣量 0.4 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 游離和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

進(jìn)行了游離細(xì)胞和外置式纖維床反應(yīng)器固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的比較，結(jié)果如圖2所示。在游離發(fā)酵模式中，50 g/L的葡萄糖在64 h后被完全消耗，丁酸最終產(chǎn)量為19.84 g/L，生產(chǎn)率為0.31 g/L/h。而固定化細(xì)胞發(fā)酵模式中的葡萄糖在48 h后被完全消耗，丁酸最終產(chǎn)量達(dá)到22.85 g/L，生產(chǎn)率達(dá)到0.48 g/L/h，比游離發(fā)酵分別提高了15%和55%。同時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率與游離細(xì)胞發(fā)酵相比提高了13%（0.46 g/g vs.0.40 g/g），發(fā)酵時(shí)間從 64 h 縮短到48 h。因此，外置式纖維床固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸比游離發(fā)酵具有明顯的優(yōu)勢(shì)。從圖2中可以看出，固定化細(xì)胞分批發(fā)酵模式可以縮短菌體的遲滯期。這一研究結(jié)果與其他類似的纖維床反應(yīng)器發(fā)酵的結(jié)果基本一致[11-12]。

圖2 游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.2 Batch fermentation for butyric acid production with free-cell and immobilized-cell

2.2 固定化細(xì)胞補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

如圖3所示，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L，所有的葡萄糖（135 g/L）在165 h后被消耗完，共產(chǎn)生30.69 g/L的丁酸。糖消耗速率和丁酸生產(chǎn)速率在每次補(bǔ)料后都有所降低，這是由于隨著丁酸濃度的增加，產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制，這與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)[11]發(fā)酵結(jié)果表明固定化補(bǔ)料分批模式有利于提高丁酸的產(chǎn)量，而本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)料分批模式未見丁酸產(chǎn)量有明顯提高，因此推測(cè)作為固定化介質(zhì)的米糠對(duì)發(fā)酵液中的丁酸鈉存在吸附作用。

圖3 固定化細(xì)胞補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.3 Fed-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell

2.3 米糠對(duì)丁酸鈉的吸附

2.3.1 米糠對(duì)丁酸鈉吸附的模擬實(shí)驗(yàn)在與發(fā)酵條件基本一致的情況下 （丁酸鈉30 g/L，pH 6.0，溫度37℃）進(jìn)行了米糠對(duì)丁酸鈉的吸附模擬實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，最后達(dá)到吸附平衡。吸附開始的前8 h，吸附量增加迅速，8 h后，吸附量增加緩慢并逐漸趨向吸附平衡，最終平衡吸附量可以達(dá)到0.084 g/g。

圖4 米糠對(duì)丁酸鈉的吸附Fig.4 Adsorption of sodium butyrate by rice bran

2.3.2 固定化發(fā)酵后的米糠對(duì)丁酸鈉的吸附將固定化補(bǔ)料分批發(fā)酵后的米糠取出烘干后，對(duì)其上吸附的丁酸鈉和酪丁酸梭菌的量進(jìn)行了測(cè)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，作為固定化介質(zhì)后的米糠對(duì)酪丁酸梭菌的吸附量為0.106 g/g，對(duì)丁酸鈉的吸附量為0.105 g/g。固定化發(fā)酵后的米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量略高于模擬實(shí)驗(yàn)中米糠對(duì)丁酸鈉的吸附量，這可能是由于在固定化發(fā)酵的長(zhǎng)期過程中，米糠的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，提高了米糠對(duì)丁酸鈉的吸附效率，此外，米糠會(huì)吸附酪丁酸梭菌，菌體中含有的丁酸鈉也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在飼料添加中，丁酸鈉的添加量通常為0.2～3 kg/t，米糠的添加量通常為50 kg/t，二者的添加比例為0.004～0.06 g/g。固定化后的米糠經(jīng)適當(dāng)稀釋后可保持與飼料添加中米糠和丁酸鈉的添加比例一致，這一發(fā)酵模式可為飼料添加提供參考。在飼料添加中，可以利用米糠作為固定化載體，發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，待發(fā)酵結(jié)束后直接將米糠投加到飼料中，米糠所吸附的丁酸鈉可以滿足動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。同時(shí)米糠吸附的酪丁酸梭菌作為益生菌有著優(yōu)異的益生、防病作用，在替代抗生素、防治疾病和改善環(huán)境方面起到了很好的作用[13]。

2.4 固定化重復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

為了觀察外置式纖維床反應(yīng)器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性能，采用了固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。在重復(fù)8次固定化分批發(fā)酵中，菌體的生長(zhǎng)過程幾乎沒有遲滯期，底物消耗速度都很快。每次更換新鮮培養(yǎng)基時(shí)，菌體的生長(zhǎng)均未出現(xiàn)遲滯期，表明固定在米糠纖維床反應(yīng)器內(nèi)的菌體具有較高的活性且穩(wěn)定。所有批次中的丁酸質(zhì)量濃度在19.03 g/L到22.58 g/L間，平均值為21.05 g/L。丁酸生產(chǎn)率從0.36 g/L/h到0.45 g/L/h不等，平均值為0.40 g/L/h。文獻(xiàn)[14]利用菊芋水解液重復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，10個(gè)批次的丁酸產(chǎn)量保持穩(wěn)定，本文的研究結(jié)果與其一致。

圖5 固定化細(xì)胞重復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.5 Repeated-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell

3 結(jié)語(yǔ)

1）本研究構(gòu)建了一種新型的外置式纖維床生物反應(yīng)器用于酪丁酸梭菌固定化分批發(fā)酵丁酸，丁酸的生產(chǎn)率比游離發(fā)酵提高了55%。

2）米糠在發(fā)酵過程中吸附丁酸鈉的量與常規(guī)飼料中丁酸鈉的添加量基本一致，因此可以作為一種簡(jiǎn)便快速的飼料添加新方式。

3）在固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式中，得到丁酸的平均濃度為21.05 g/L，外置式纖維床反應(yīng)器展現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性。這對(duì)于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)丁酸及丁酸鈉在飼料中的添加新途徑具有一定的指導(dǎo)意義。