葉玉蘭，劉單，鄧述愷

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學一科，四川 瀘州 646000）

選擇環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）抑制劑塞來昔布（Celecoxib,Cele）具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛作用。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，Cele 對包括肺癌[1]在內(nèi)的多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出抗癌活性[2-3]，但具體機制尚未完全明確。培美曲塞（Pemetrexed,Pem）是一種多靶點的抗葉酸化療藥物，被推薦用于非鱗非小細胞肺癌的一線治療[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol -3-kinase,PI3K）家族是一類重要激酶，而蛋白激酶B（protein kinase,B）是PI3K 信號通路的核心靶點。 PI3K/AKT 通路廣泛存在真核細胞中，與細胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)密切相關[5]。本實驗擬通過Cele、Pem單藥和聯(lián)合用藥與人肺腺癌A549 細胞共培養(yǎng)，研究Cele 與Pem 聯(lián)合對肺癌細胞的增殖、凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機制，以期為臨床肺癌化療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

A549 細胞株（西南醫(yī)科大學中心實驗室），Cele（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），Pem（美國Selleck 生物科技有限公司），CCK-8 檢測試劑盒、細胞凋亡及周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），HyClone 改良型RPMI 1640 培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司），BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（武漢阿斯本生物技術有限公司），兔抗人AKT 一抗及p-AKT 一抗（美國CST 公司），內(nèi)參GAPDH 抗體（英國Abcam 公司），山羊抗兔二抗（南非Aspen 公司），流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞復蘇、培養(yǎng)及傳代 將A549 細胞株培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，置于5%二氧化碳CO2、37℃、恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，貼壁生長至85%時用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8 法檢測不同濃度下細胞組增殖抑制率和光密度（OD）值 將A549 細胞接種于96 孔板，溫育24 h，加入Cele（0、5、10、20、40 及80 μmol/L）、Pem（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L）后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，CCK-8 法檢測OD 值，并計算半抑制濃度（IC50）用于后續(xù)實驗的藥物濃度。

1.2.3 CCK-8 法檢測各實驗組細胞增殖抑制率 將A549 細胞接種于96 孔板，分為對照組（加入培養(yǎng)液）和實驗組，實驗組又分為Cele 組（加入IC50濃度的Cele）、Pem 組（加入IC50濃度的Pem）、Cele+Pem組（加入IC50濃度的Cele 和Pem），每組設5 個復孔。37℃5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、36 和48 h 取出，加入CCK-8 試劑，孵育4 h。酶標儀測量450 nm 波長處的OD 值，計算增殖抑制率。結合前期預實驗，48 h增殖抑制效果最佳，擇其作為后續(xù)藥物實驗干預時間。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將A549 細胞接種于6 孔板，分組同1.2.3 部分，室溫孵育48 h，收集細胞；加入300 μl Binding Buffer 懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，避光孵育10 min，再加入5 μl PI，混勻，避光孵育5 min，上機檢測。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期分布 將A549 細胞接種于6 孔板，分組同1.2.3，室溫孵育48 h，收集細胞，PBS 洗3 次，加入預冷的70%乙醇，4℃固定過夜。收集細胞，PBS 洗滌3 次，加入500 μl RNase/PI 重懸細胞，避光染色20 min，上機檢測。

1.2.6 Western blotting 檢測AKT、p-AKT 蛋白水平 將A549 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，分組同1.2.3，室溫孵育48 h，裂解液裂解細胞后提取總蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，制定標準曲線，計算各組蛋白濃度。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，AKT 及p-AKT 一抗4℃過夜，TBST 洗膜，加二抗，洗膜，ECL 發(fā)光劑顯影，拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量設計的方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗，方差齊性檢測采用Levene 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。金氏法評價兩藥聯(lián)合的相互關系，計算公式：Q 值= EA+B/（EA+EB-EA×EB）。結果判讀：若Q 值＜1，兩藥之間相互拮抗；Q 值=1，兩藥之間作用相加；Q值＞1，兩藥之間相互協(xié)同。所有實驗過程均重復3 次。

2 結果

2.1 不同濃度Cele 和Pem 單藥對A549 細胞增殖的抑制作用及IC50

濃度為5、10、20、40 及80 μmol/L Cele 干預組細胞增殖抑制率分別為（17.300±3.988）%、（39.504± 1.656）%、（47.236±1.895）%、（51.662±5.387）% 和（63.379±1.986）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=133.341，P=0.000），隨著藥物濃度增加，各組細胞增殖抑制率逐漸上升，但低濃度Cele（5 μmol/L）抑制作用與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L Pem 干預組細胞生長抑制率分別為（28.976±3.483）%、（46.072±1.249）%、（60.735± 2.892）%、（70.359±3.886）%和（79.545±2.531）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=230.315，P=0.000），隨著藥物濃度增加，各組細胞增殖抑制率逐漸上升。實驗得知Cele IC50值為30.51 μmol/L，Pem IC50值為1.33 μmol/L。 見圖1。

2.2 Cele 聯(lián)合Pem 對A549 細胞增殖的抑制作用

IC50濃度條件下，各實驗組與對照組作用于A549細 胞24、36 和48 h 對A549 細 胞增殖 抑 制 作用比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞增殖抑制率有差異（F=1107.544，P= 0.000）；②兩組細胞的增殖抑制率有差異（F=149.865，P=0.000）；③兩組的增殖抑制變化趨勢有差異（F= 2291.635，P=0.000）。見表1。

2.3 金氏法評價Cele 聯(lián)合Pem 對A549 細胞增殖抑制作用

Cele 聯(lián)合Pem 與A549 共培養(yǎng)48h，Q 值為1.001，約等于1，說明Cele 與Pem 聯(lián)合干預體外培養(yǎng)的A549細胞增殖。

圖1 不同濃度Cele 和Pem 作用于A549 細胞 48 h 的增殖抑制率比較 （±s）

2.4 Cele 聯(lián)合Pem 對A549 細胞凋亡的影響

作用于A549 細胞48 h 條件下，對照組、Cele 組、Pem 組及Cele+Pem 組細胞凋亡率分別為（2.900± 0.900）%、（10.190±1.778）%、（11.813±0.846）%和 （24.630±0.252）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=208.388，P=0.000）；各實驗組細胞凋亡率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），均有所上升；Cele+Pem 組細胞凋亡率與Cele 組、Pem 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Cele+Pem 組細胞凋亡率增加；而Cele組細胞凋亡率與Pem 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

2.5 各組A549 細胞周期分布情況

作用于A549 細胞48 h 條件下，對照組、Cele組、Pem 組及Cele+Pem 組G0/G1 分別為（52.487± 0.267）%、（65.393±0.368）%、（65.577±0.064）% 和（75.143±0.778）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=1270.915，P=0.000）；與對照組比較，各實驗組G0/G1 細胞比例均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Cele+Pem 組細胞G0/G1 細胞比例與Cele 組、Pem 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Cele+Pem 組增加；而Cele 組G0/G1細胞比例與Pem組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見圖2。

2.6 Cele+Pem 對A549 細胞AKT、p-AKT 蛋白表達的影響

作用于A549 細胞48 h 條件下，對照組、Cele組、Pem 組及Cele+Pem 組p-AKT/GAPDH 值分別為（0.544±0.033）、（0.267±0.042）、（0.157±0.014）和（0.063±0.021），4 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 148.409，P=0.000）；對照組、Cele 組、Pem 組 及Cele+Pem 組AKT/GAPDH 值分別為（0.684±0.054）、（0.656±0.025）、（0.673±0.021）和（0.648±0.011），4 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.748，P=0.553）；與對照組比較，p-AKT/GAPDH 值在Cele 組、Pem 組及Cele+Pem 組均下調(diào)（P＜0.05），且Pem 組p-AKT/GAPDH 值低于Cele 組（P＜0.05），Cele+Pem 組p-AKT/GAPDH 值與Cele 組和Pem 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3～5。

表1 Cele、Pem 單藥和聯(lián)合用藥不同時間條件下對A549 細胞增殖的影響 （±s）

表1 Cele、Pem 單藥和聯(lián)合用藥不同時間條件下對A549 細胞增殖的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與Pem 組比較，P ＜0.05；3）與Pem 組比較，P ＜0.05；4）與Cele 組比較，P ＜0.05；5）與24 h 比較，P ＜0.05

組別24 h 36 h 48 h OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/%對照組 0.994±0.013 - 1.038±0.039 - 1.158±0.047 -Cele 組 0.816±0.004 18.311±0.4311）2） 0.701±0.010 32.314±1.0111）2）5） 0.581±0.048 49.743±4.1861）5）Pem 組 0.805±0.007 19.510±0.6781） 0.665±0.015 35.513±1.4741）5） 0.588±0.023 49.192±1.7781）5）Cele+Pem 組 0.724±0.005 26.755±0.5541）3）4） 0.443±0.018 57.098±1.7851）3）4）5） 0.320±0.037 72.370±3.2321）3）4）5）

圖2 各組A549 細胞周期分布情況

圖3 A549 細胞中p-AKT 及AKT 蛋白的表達

圖4 A549 細胞中p-AKT 蛋白的表達 （±s）

圖5 A549 細胞中AKT 蛋白的表達 （±s）

3 討論

選擇COX-2 抑制劑Cele，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛作用，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，Cele 對包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出抗癌活性[1-3]，其可能的機制為：阻斷細胞周期進展，抑制細胞增殖及血管生成，誘導細胞凋亡[6-7]；抑制癌細胞浸潤及轉(zhuǎn)移[8-9]相關。KIM 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Cele 能夠觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，誘導人非小細胞肺癌細胞系A549 和H460 細胞凋亡。ZHANG 等[11]分別用Cele 和XIAP-shRNA 單獨或聯(lián)合作用于A549 細胞，發(fā)現(xiàn)各實驗組增殖率均表現(xiàn)出下降，細胞凋亡上升。CAI 等[12]報道，當Cele 作用于體外孵育的A549，G0/G1 期細胞群由41.2%增至60.5%，從而認為Cele 能夠誘導G0/G1 期停滯，影響細胞周期進展，在H1299 細胞株中也得到相似結果。與該結果類似，本實驗結果表明，較高濃度Cele（10、20、40 及80 μmol/L）可抑制A549 細胞的增殖和活力，但低濃度Cele（5 μmol/L）抑制作用與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。另外與對照組比較，Cele 能夠增加A549 細胞G0/G1 期比例。

某項薈萃分析報道[13]，Cele 聯(lián)合化療可以顯著改善晚期NSCLC 治療的總體有效率。本實驗通過使用Cele、Pem 單藥和聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的A549細胞，結果顯示，與對照組比較，Cele、Pem 均呈濃度依賴性抑制A549 細胞增殖，且在IC50濃度條件下，Cele、Pem 呈一定時間依賴性抑制A549 細胞增殖，Cele+Pem 組抑制作用最強；各實驗組A549細胞凋亡率及G0/G1 期細胞比例均有不同程度升高。WU 等[14]分析Pem 與作用于A549 細胞24 及48 h 后細胞周期分布情況，發(fā)現(xiàn)其呈劑量及時間依賴性誘導G1 期阻滯，另有學者報道[15]，將PC9 細胞同時暴露于Pem 和吉非替尼將導致明顯G1 阻滯，本實驗結果與之類似。金氏法顯示Cele 聯(lián)合Pem 作用于A549 48 h，Q 值為1.001，說明兩者聯(lián)合對A549 細胞增殖抑制起到相加作用，Cele 能增強Pem 抗腫瘤效應。

真核細胞中廣泛存在PI3K/AKT 信號通路，原癌蛋白AKT 被認為是PI3K 下游中心效應分子，參與細胞生長、增殖、分化的調(diào)節(jié)。PI3K 能夠通過AKT 將細胞分裂信號向下游傳遞，調(diào)控細胞周期蛋白D 表達，通過周期蛋白D1-CDK4-Rb 調(diào)控細胞周期，從而影響細胞增殖[16-18]。此外，p-AKT 能使Bcl-2（抗凋亡蛋白）從聚合體中釋放出來，從而發(fā)揮抗凋亡作用。據(jù)報道，Cele 可抑制前列腺癌PC-3 細胞株中p-AKT 的表達，從而誘導細胞凋亡[19]；在非小細胞肺癌中，研究者發(fā)現(xiàn)放療可以促進A549 細胞中p-AKT 的表達，而與各對照組相比，厄洛替尼+Cele 聯(lián)合放療組p-AKT 表達水平最低，從而認為厄洛替尼聯(lián)合Cele 可能通過抑制PI3K/AKT 信號通路增強放療的抗腫瘤效果[20]。以上研究提示AKT 可能是Cele 的作用靶點之一。本實驗結果還發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，Cele+Pem 組p-AKT 蛋白表達下降，而AKT 蛋白表達水平組間差異無統(tǒng)計學意義。表明AKT/p-AKT 至少部分參與了Cele 與Pem聯(lián)合抗腫瘤的過程。

本研究表明，Cele 可增強Pem 抑制人肺腺癌A549細胞增殖、誘導細胞凋亡作用，其機制可能與誘導細胞周期G0/G1 期阻滯，抑制PI3K/AKT 通路相關蛋白AKT活性相關。其聯(lián)合應用有望成為治療NSCLC 的有效策略，但尚需進一步體內(nèi)實驗及相關臨床試驗進行驗證。