韋永先 覃 濤 盧俊宇 楊葉桂 陳蒙華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南寧市 530007，電子郵箱：wyx0238@sina.com.cn)

心肌細胞鈣超載可影響細胞興奮-收縮偶聯(lián)，從而導(dǎo)致心肌持續(xù)強直性收縮[1-2]、左室舒張壓和每搏輸出量順行性下降，大體病理表現(xiàn)為典型的“石頭心”[3-4]。鈣超載時心肌的順應(yīng)性極差，隨著左室舒張壓的逐漸下降，心臟失去泵血功能，幾乎不能接受回流的血液[5]，患者的預(yù)后不佳。本課題組前期動物實驗結(jié)果顯示，心搏驟停大鼠復(fù)蘇失敗的主要原因是發(fā)生了“石頭心”；且大鼠心搏驟停持續(xù)時間越長或心肺復(fù)蘇時間越長，發(fā)生“石頭心”的概率越大[6]。而臨床研究表明，高鉀灌注液能夠抑制心肌細胞內(nèi)的鈣超載，減少心肌細胞的缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)[7-11]，其潛在機制可能與高血鉀提高心肌細胞對IRI的耐受性、拮抗鈣超載、抑制心肌過度收縮、維持心肌一定的順應(yīng)性有關(guān)。若一定程度高血鉀狀態(tài)可減輕心肌持續(xù)缺血后鈣超載程度，這可能會對臨床上心搏驟停高危人群的防治起到一定的指導(dǎo)作用。因此，本研究通過靜脈注射氯化鉀以升高大鼠體內(nèi)血鉀濃度，再采用電刺激法建立心搏驟停模型，旨在探討高血鉀預(yù)處理對心搏驟停模型大鼠的心肺復(fù)蘇成功率、心肌舒張功能及順應(yīng)性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠90只，8～12周齡，體重210～230 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(桂)2014-0002。大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。本研究符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，在獲得廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物管理和應(yīng)用委員會的許可后開展實驗。研究過程中，保障動物生活棲息場的溫度、濕度、氣流、采光、清潔衛(wèi)生狀況，提供充足清潔的飲用水和食物；在操作過程中，尊重及善待動物，避免其恐懼及不安，減少對動物的傷害，采用傷害最小的方式處置動物。

1.2 主要儀器和試劑 BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)(四川成都泰盟儀器公司)，RWD407型小型動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。氯化鈉注射液(廣東大冢制藥有限公司，批號：H44020186)，10%氯化鉀溶液(湖北天圣藥業(yè)有限公司，批號：H42020421)，水合氯醛(成都科龍化工，批號：2016092901)

1.3 動物分組 將90只大鼠按隨機數(shù)字表法分為高血鉀預(yù)處理組和生理鹽水組，每組45只，再將兩組大鼠按隨機數(shù)字表法分別分為3個亞組，即6 min高血鉀預(yù)處理(HK 6min)組、9 min高血鉀預(yù)處理(HK 9min)組、12 min高血鉀預(yù)處理(HK 12min)組和6 min生理鹽水(NS 6min)組、9 min生理鹽水(NS 9min)組、12 min生理鹽水(NS 12min)組，每組15只。

1.4 預(yù)處理及心臟驟停模型的建立方法 (1)預(yù)處理：室溫環(huán)境下，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺后備皮消毒、于左側(cè)腹股溝作一約1 cm的縱向切口，分離大鼠左側(cè)股動、靜脈，分別置入1條20 G留置管(管內(nèi)充滿5 IU/ml肝素鈉生理鹽水)。高血鉀預(yù)處理組、生理鹽水組從股靜脈留置管分別注入80 μg/g的10%氯化鉀、等量生理鹽水。(2)大鼠心臟驟停模型的建立：采用經(jīng)食道交流電刺激誘導(dǎo)的方法建立大鼠心臟驟停模型[12]。經(jīng)股靜脈給予氯化鉀或生理鹽水5 min后，將雙極F6臨時起搏電極經(jīng)口送入大鼠食道內(nèi)，深度為5～6 cm(即在大鼠心臟搏動最強的后方)，選用12 V電壓的交流電刺激60 s后，停止電刺激觀察心電圖及心電監(jiān)護，若仍出現(xiàn)自主心律或血壓回升，則附加1次20 s的12 V電刺激，直至心電監(jiān)護持續(xù)顯示無脈性電活動或心跳停搏狀態(tài)。成功誘發(fā)心臟驟停的標(biāo)準(zhǔn)：心電監(jiān)護顯示無脈性電活動，有創(chuàng)血壓監(jiān)測顯示無搏動波，平均動脈壓<10 mmHg，見圖1。

圖1 電刺激成功誘發(fā)大鼠心搏驟停效果圖

1.5 干預(yù)方法 (1)干預(yù)的時機：HK 6min組和NS 6min組：在電刺激誘發(fā)心搏驟停6 min后開始心肺復(fù)蘇；HK 9min組和NS 9min組：在電刺激誘發(fā)心搏驟停9 min后開始心肺復(fù)蘇；HK 12min組和NS 12min組：在電刺激誘發(fā)心搏驟停12 min后開始心肺復(fù)蘇。(2)心肺復(fù)蘇方法：連接動物胸外按壓器，按壓頻率設(shè)定為180次/min，按壓深度約為大鼠胸廓前后徑的1/3,按壓與松開時間的比例為1 ∶1，同時用14 G氣管套管經(jīng)口行氣管插管，連接呼吸機進行機械通氣，通氣頻率設(shè)定為70次/min，潮氣量設(shè)定為6 ml/kg。實驗過程中維持室溫26℃，使用加熱燈控制維持體溫，全程監(jiān)測動物肛溫維持在(37.0±0.5)℃[12]。若心肺復(fù)蘇過程中未能自主循環(huán)恢復(fù)(restoration of spontaneous circulation,ROSC)，分別在開始按壓后的第1、4、7 min給予靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg)，心肺復(fù)蘇超過10 min大鼠未ROSC則定義為復(fù)蘇失敗，ROSC的標(biāo)準(zhǔn)：心電監(jiān)護示室上性節(jié)律(包括竇性、房性或交界性心律)伴有平均動脈壓≥50 mmHg，持續(xù)5 min以上。心肺復(fù)蘇過程中持續(xù)給予機械通氣，待大鼠血流動力學(xué)穩(wěn)定15 min后停止機械通氣；同時持續(xù)給予心電監(jiān)護及動脈血壓監(jiān)測，動脈血壓

監(jiān)測方法：股動脈留置管與BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)的壓力換能器相連，四肢經(jīng)皮下針頭記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，心電描記速度為125 ms/div。

1.6 觀察指標(biāo) (1)各組大鼠的復(fù)蘇成功率以及復(fù)蘇成功大鼠心肺復(fù)蘇成功所需時間，其中心肺復(fù)蘇成功所需時間指自心肺復(fù)蘇開始到ROSC的時間，復(fù)蘇成功率=各組復(fù)蘇成功大鼠數(shù)量/各組大鼠數(shù)量×100%。(2)各組復(fù)蘇失敗大鼠終止心肺復(fù)蘇前按壓狀態(tài)下的舒張壓、心臟硬度評分和“石頭心”的發(fā)生率。心臟硬度評分：心臟的硬度分為5級，每級記1分，其中1級為指尖觸摸大鼠心臟如口唇硬度，3級為指尖觸摸大鼠心臟如鼻尖硬度，5級為指尖觸摸大鼠心臟如額頭硬度，2級和4級分別介于1級與3級和3級與5級硬度之間[9]。心臟硬度評分≥3分判斷為“石頭心”?！笆^心”發(fā)生率=各組發(fā)生“石頭心”大鼠數(shù)量/各組大鼠數(shù)量×100%。

1.7 實驗質(zhì)量 實驗開展前對實驗人員進行嚴(yán)格的培訓(xùn)，包括儀器使用及檢測方法等；定期檢查、校準(zhǔn)實驗測量儀器，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；控制實驗室的溫度、濕度、光線等，保障外界環(huán)境的一致性；實驗操作過程中，實驗人員分工明確；嚴(yán)格按照模型制作標(biāo)準(zhǔn)，剔除不合格的樣本。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠一般情況比較 實驗前6組大鼠體重、心率、體溫、平均動脈壓及電刺激用時比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。所有大鼠均成功誘導(dǎo)心臟驟停。

表1 6組大鼠一般情況比較(x±s)

2.2 6組大鼠心肺復(fù)蘇成功率及所需時間的比較 HK 6min組、HK 9min組、HK 12min組大鼠復(fù)蘇成功率依次降低，高于相應(yīng)間隔時長的生理鹽水組(均P<0.05)，見表2。HK 6min組、HK 9min組、HK 12min組心肺復(fù)蘇成功所需時間依次延長，且HK 6min組、HK 9min組所需時間短于NS 6min組、NS 9min組(均P<0.05)，見表3。

表2 6組大鼠復(fù)蘇成功率比較[n(%)]

注：與HK 6min組比較，*P<0.05；與HK 9min組比較，#P<0.05；與HK 12min組比較，▲P<0.05。

表3 6組復(fù)蘇大鼠心肺復(fù)蘇成功所需時間比較(x±s，min)

注：與HK 6min組比較，*P<0.05；與HK 9min組比較，#P<0.05。

2.3 復(fù)蘇失敗大鼠心肌順應(yīng)性情況比較 打開復(fù)蘇失敗大鼠胸腔后可觀察到，生理鹽水組大鼠心臟攣縮明顯，而高血鉀預(yù)處理的大鼠心臟仍保持一定腔隙結(jié)構(gòu)，見圖2。在復(fù)蘇失敗的大鼠中,HK 9min組、HK 12min組心臟硬度評分、“石頭心”發(fā)生率均分別低于NS 9min組、NS 12min組，終止復(fù)蘇前舒張壓分別高于NS 9min組、NS 12min組(均P<0.05)，見表4。

圖2 高血鉀預(yù)處理與生理鹽水組復(fù)蘇失敗大鼠心臟大體圖

組別n心臟硬度評分(x±s,分)“石頭心”[n(%)]終止心肺復(fù)蘇前舒張壓(x±s,mmHg)HK 6min組0———NS 6min組73.4±1.35(71.4)1.7±0.5HK 9min組61.7±0.6026.4±5.3NS 9min組134.2±0.7?13(100.0)?1.2±0.3?HK 12min組101.9±0.72(20.0)26.2±5.2NS 12min組154.7±0.5#15(100.0)#1.1±0.3# F(χ2)值32.66236.933203.938P值<0.001<0.001<0.001

注：與HK 9min比較，*P<0.05；與HK 12min組比較，#P<0.05。

3 討 論

正常人體內(nèi)含鉀總量為50～55 mmol/kg，其中約98%的鉀離子存在于細胞內(nèi)，是細胞內(nèi)最主要的陽離子。鉀離子是維持細胞膜靜息電位的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時還參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓和酸堿平衡以及體內(nèi)多種新陳代謝過程[13]。人體內(nèi)正常的血清鉀濃度為3.5～5.5 mmol/L，在臨床上高血鉀(血清鉀濃度>5.5 mmol/L)或嚴(yán)重高血鉀(血清鉀濃度>7.0 mmol/L)的最主要危害是引起心室顫動和心臟驟停[14]。高血鉀導(dǎo)致心肌細胞靜息電位減小，從而造成興奮細胞所需的閾刺激也相對減小，心肌細胞興奮性增高；同時還造成動作電位除極幅度減小、細胞的興奮性擴布減慢，導(dǎo)致傳導(dǎo)性降低；血鉀升高可造成鈣離子內(nèi)流延遲，并激活鈉-鉀泵促進鈉-鈣交換，使得細胞內(nèi)鈣外流增多，細胞內(nèi)鈣離子濃度下降，心肌細胞興奮-收縮偶聯(lián)受影響[1-2，15]。

隨著相關(guān)心臟手術(shù)以及介入治療手段在急性冠脈綜合征中的廣泛應(yīng)用，心肌細胞的IRI越來越受到臨床重視[16-17]。目前，在關(guān)于心肌細胞IRI的研究中，低鉀給心臟帶來的損害已得到普遍認可[18-20]，而關(guān)于高鉀液減輕心肌細胞鈣超載的研究也已在細胞及器官層面上得到證實，同時研究也逐漸深入至離子通道的相關(guān)機制。動物實驗研究表明，高鉀可以使心肌細胞鈣通道較早關(guān)閉，減少鈣內(nèi)流，抑制心肌過度收縮，使心臟處于舒張狀態(tài)，且可在心臟停跳階段大幅度地減少心肌細胞的能量消耗，從而有利于心臟功能的恢復(fù)[7，21-23]。句海松等[7]通過建立離體大鼠心臟灌流模型發(fā)現(xiàn)，一定程度的高鉀能保護心肌細胞膜上的Na+-K+-三磷酸腺苷酶活性，抑制細胞內(nèi)鈣和鈉的過負荷；同時還發(fā)現(xiàn)即使在心臟驟停后予少量高鉀溶液灌注，也能減輕心肌細胞的IRI，其機制可能與減輕鈣超載有關(guān)。有學(xué)者在大鼠及兔的心肌缺血再灌注模型研究中也發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注過程中細胞外鉀離子濃度的不均一性是造成再灌注心律失常的重要原因，再灌注早期短暫給予高鉀液可顯著減輕再灌注心肌細胞的損傷[9-10]。

研究結(jié)果顯示，通過靜脈注射氯化鉀建立的小鼠心臟驟停模型小鼠心臟停跳時間(10～12 min)明顯長于采用電刺激法建立的心臟驟停模型(4～5 min)[24-27]，且復(fù)蘇成功率高于電刺激法模型[26-27]。因此，為了排除靜脈注射氯化鉀本身對模型帶來的干擾，本研究采用電刺激法建立心臟驟停模型。

本研究結(jié)果顯示，與相應(yīng)間隔時長的生理鹽水組比較，HK 6min組、HK 9min組、HK 12min組大鼠復(fù)蘇成功率均較高，且心肺復(fù)蘇成功所需時間均縮短(均P<0.05)，提示高血鉀預(yù)處理可提高對心臟驟停模型大鼠的心肺復(fù)蘇質(zhì)量，考慮為高血鉀預(yù)處理對心臟驟停模型大鼠心臟IRI起到抑制作用，對缺血缺氧的心肌具有保護作用。且HK 6min組、HK 9min組、HK 12min組大鼠復(fù)蘇成功率依次降低，心肺復(fù)蘇所需時間依次延長(均P<0.05)，提示隨著心臟驟停時間的延長，大鼠復(fù)蘇成功率降低。

“石頭心”是缺血性心肌攣縮的一種嚴(yán)重形式，具體表現(xiàn)為心室游離壁漸進性增厚和心室腔的不斷縮小。Klouche等[3]在誘導(dǎo)豬發(fā)生室顫的實驗中描述了“石頭心”的存在，且發(fā)現(xiàn)隨著室顫持續(xù)時間延長，心臟的左室舒張末壓和每搏輸出量出現(xiàn)順行性下降。Takino等[5]發(fā)現(xiàn)心肌攣縮與心肺復(fù)蘇的結(jié)局密切相關(guān)，“石頭心”患者通常以復(fù)蘇失敗而告終。Koretsune等[28]的研究也表明，心肌出現(xiàn)能量代謝障礙時會導(dǎo)致“石頭心”的發(fā)生，且其可能與鈣離子濃度升高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HK 9min組、HK 12min組復(fù)蘇失敗大鼠終止復(fù)蘇前的舒張壓分別高于NS 9min組、NS 12min組(均P<0.05)，提示高血鉀預(yù)處理可以使心搏驟停大鼠心臟一定舒張功能，保證心肌在按壓時仍可通過心肌舒張接受回心血流、處于可泵血的狀態(tài)，為復(fù)蘇成功在結(jié)構(gòu)和功能上提供了基礎(chǔ)。此外，HK 9min組、HK 12min組復(fù)蘇失敗大鼠心臟硬度評分、“石頭心”的發(fā)生率分別低于NS 9min組、NS 12min組(均P<0.05)。提示高血鉀預(yù)處理還可以降低復(fù)蘇失敗大鼠的心臟硬度評分，在整個復(fù)蘇階段其心肌仍能保持一定的順應(yīng)性，心肌未因過度攣縮而失去舒張功能，形成所謂的“石頭心”。其機制可能與高血鉀通過拮抗鈣超載、抑制心肌細胞收縮-舒張功能，從而達到松弛心肌、降低耗氧及抑制心肌過度收縮等有關(guān)。

綜上所述，高血鉀預(yù)處理可以提高對心搏驟停大鼠的心肺復(fù)蘇質(zhì)量，但隨著心搏驟停持續(xù)時間的延長，大鼠的復(fù)蘇成功率下降。心肺復(fù)蘇過程中高血鉀預(yù)處理可能通過抑制鈣超載從而抑制心肌過度攣縮，改善心搏驟停大鼠心肌順應(yīng)性，為復(fù)蘇成功在結(jié)構(gòu)和功能上提供了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果或可為臨床上心搏驟停高危人群的防治提供一定的參考。