付文靜 董 晨 禹金龍 胡 潔 江 蕓

(1. 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210097；2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210097)

與人類疾病相關(guān)的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(shiga toxinescherichiacoli, STEC)最主要的血清型是大腸桿菌O157:H7[1-2]。然而，近年來，關(guān)于非O157 STEC，尤其是“big six” STEC(O26、O45、O103、O111、O121、O145)暴發(fā)事件的報(bào)道逐漸增多，國外尤其是發(fā)達(dá)國家對(duì)“big six” STEC的關(guān)注度越來越高。由于其傳染劑量低，且相關(guān)的疾病暴發(fā)病例數(shù)量多，自2012年美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)局(USDA-FSIS)宣布這6個(gè)主要血清型為生肉、絞碎牛肉和牛肉產(chǎn)品的必檢病原體[3]。向美國出口牛肉的設(shè)施必須符合FSIS制定的標(biāo)準(zhǔn)，以防止產(chǎn)品摻入STEC細(xì)菌[1,4-6]。因此，了解非O157大腸桿菌的污染情況、采取有效防控措施是當(dāng)下迫切需要解決的問題。

國外相關(guān)報(bào)道[6-8]表明O26是非O157大腸桿菌中最主要的血清型，已成為美國、亞洲、歐洲等STEC食源性感染的第二大常見原因。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心2010年報(bào)告[9]，在非O157 STEC感染事件中，患病率從高到低依次為22%O26、16%O111、12%O103、8%O121、7%O45和5%O145。O26 STEC可導(dǎo)致人類的廣泛感染，從輕度腹瀉到出血性結(jié)腸炎(HC)，在某些情況下導(dǎo)致溶血性尿毒癥綜合征(HUS)[10]。O26感染暴發(fā)可發(fā)生在牛肉、與牛接觸的農(nóng)產(chǎn)品和人對(duì)人傳播[11-12]。反芻動(dòng)物，尤其是牛，是O157和非O157 STEC的主要污染源[13]，通過糞便排泄到環(huán)境，進(jìn)而可污染水、新鮮農(nóng)產(chǎn)品、牛肉及其制品。牛的屠宰加工與分割是牛肉質(zhì)量最初的保證環(huán)節(jié)，決定著儲(chǔ)藏前分割牛肉的產(chǎn)品質(zhì)量，也是后續(xù)加工的基礎(chǔ)。然而牛肉在屠宰加工中會(huì)受到來自于空氣、水、糞便、皮毛、內(nèi)臟、淋巴結(jié)、工具、容器和屠宰操作者等各個(gè)方面帶來的微生物的污染，污染的方式和程度主要取決于加工和處理方法的衛(wèi)生控制措施及儲(chǔ)藏和配給環(huán)境等。目前中國對(duì)非O157的研究尚較少[14]。本試驗(yàn)擬以非O157大腸桿菌中最主要的血清型O26為對(duì)象，選擇某規(guī)范化牛屠宰場，對(duì)屠宰過程中牛胴體及環(huán)境樣品進(jìn)行大腸桿菌O26的分離與鑒定，以了解其污染狀況，以期為非O157大腸桿菌的食品安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大腸桿菌O157:H7(編號(hào)CICC21530)：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

大腸桿菌DH5α、1株大腸桿菌O26陽性菌DNA全基因組：江蘇省疾病預(yù)防控制中心；

改良胰蛋白胨大豆肉湯(modified tryptic soy broth, mTSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar, TSA)、酵母浸粉(yeast extract)、亞碲酸鉀、頭孢克肟、P-10A新生霉素、P-10B新生霉素：北京路橋技術(shù)有限公司；

TaqTM(with Mg2+free buffer)、100 bp DNA Marker：大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司；

Qiagen multiplex PCR kit：德國Qiagen公司；

瓊脂糖：北京天根生化科技有限公司；

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、4S Red染料：上海生工生物科技有限公司；

Rainbow agar培養(yǎng)基：美國BIOLOG公司；

免疫磁珠試劑盒：美國Romer labs?公司；

O26抗原血清：日本生研公司；

所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PCR儀：Mastercycler personal型，德國Eppendorf公司；

凝膠成像儀：GelDoc 2000 system型，美國BioRad公司；

高速離心機(jī)：TCL-16G型，上海安亭儀器廠；

瓊脂糖凝膠電泳儀：DYY-2C型，上海天能科技有限公司；

生物安全柜：SG403A Sterile GDRD型，美國Baker公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-150型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 選擇安徽省某規(guī)范化牛屠宰場，對(duì)屠宰過程中牛胴體及環(huán)境樣品進(jìn)行大腸桿菌O26的分離與鑒定，不同部位采樣均采用無菌棉簽涂抹方法。

(1) 牛胴體表面采樣：本次共屠宰15頭牛，試驗(yàn)隨機(jī)選擇其中5頭牛胴體進(jìn)行表面采樣。對(duì)胴體內(nèi)外表面分散在8～10個(gè)不同部位采樣，均勻揩抹3次，迅速剪斷棉簽頭落入裝有25 mL已滅菌生理鹽水的采樣管中，每個(gè)部位用3～5支棉簽。

(2) 刀具采樣：用滅菌棉簽蘸滅菌生理鹽水后在刀的兩面從刀尖涂抹到刀把，分別用6只棉簽涂抹到整個(gè)刀片，迅速剪斷棉簽頭，使之落入裝有25 mL生理鹽水的采樣管中。

(3) 工人手采樣：工人五指并攏，用3支蘸濕滅菌生理鹽水的棉簽在左右手，往返涂擦，剪去棉簽頭，裝入含25 mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)。

(4) 污水及血水采樣：用一次性無菌吸管吸取30 mL污水(血水)樣品放入滅菌50 mL采樣管中。

1.2.2 樣品前增菌 采集的樣品在24 h內(nèi)進(jìn)行增菌處理，參考美國農(nóng)業(yè)部方法及Svoboda等[15-16]的方法，稍作調(diào)整，進(jìn)行增菌培養(yǎng)：將采集的樣品及生理鹽水放入均質(zhì)袋中，均質(zhì)2～3 min，取10 mL均質(zhì)液加入到含有40 mL mTSB的均質(zhì)袋中，于37 ℃，220 r/min搖床中培養(yǎng)22 h。

1.2.3 免疫磁珠法分離大腸桿菌O26 增菌后取1 mL的樣品于1.5 mL離心管中，同時(shí)加入50 μL免疫磁珠。短暫渦旋混合，在室溫下?lián)u動(dòng)樣品15 min后，將樣品管放置在磁分離架上5 min，使得磁珠吸在管壁上，棄去懸浮液；加入已滅菌的0.05% Tween20 PBS溶液1 mL重懸，重復(fù)上述步驟3次；最后用1 mL洗滌緩沖液重建樣品，渦旋混合。處理后的樣品取100 μL涂布于改良Rainbow agar培養(yǎng)基(modified rainbow agar, mRBA，添加0.05 mg/L 頭孢克肟，0.15 mg/L亞碲酸鉀，5.0 mg/L新生霉素)，在37 ℃培養(yǎng)24～36 h，按照mRBA說明書及美國農(nóng)業(yè)部指導(dǎo)說明，挑取特征顏色的菌落，在mRBA培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線，經(jīng)3次分離純化，挑取單菌落劃線于非選擇性培養(yǎng)基TSA-YE上保存，以待進(jìn)一步鑒定。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA提取 采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA[17]。將可疑菌株挑一環(huán)于150 μL滅菌雙蒸水中，渦旋，充分混勻。99 ℃水浴處理10 min，冰浴2 min，12 000×g離心2 min，吸取上清即為細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR檢測O26及血清凝集試驗(yàn) O26血清型鑒定用引物參考Machado等[18](表1)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括1 μL模板，PCR Master Mix 12.5 μL，O26上、下游引物(濃度均為10 μmol/L)各0.8 μL，不足部分用水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對(duì)PCR陽性的菌株，采用O血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 多重PCR毒力基因檢測 大腸桿菌O26血清型陽性的菌株采用多重PCR進(jìn)行stx1、stx2、eae、hly4種毒力基因攜帶情況檢測。引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl 5 μL，4對(duì)引物(10 μmol/L)mix 9.4 μL，Taq酶0.25 μL，DNA模板1 μL，不足部分用水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性7 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃退火40 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增長度

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)一步計(jì)算污染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌O26的檢出率

共收集了該屠宰場120份樣品，包括地面樣品3份、血水樣品4份、污水樣品8份、工具樣品17份、工人手樣品7份、紅內(nèi)臟樣品16份、白內(nèi)臟樣品16份、胃內(nèi)容物樣品2份、胴體樣品45份、肉品殘?jiān)鼧悠分?份(表2)。各樣品經(jīng)前增菌、免疫磁珠富集、選擇性培養(yǎng)基mRBA分離純化后，挑取可疑菌落采用煮沸法提取DNA，進(jìn)行O26血清型的PCR檢測(圖1)，結(jié)果僅擴(kuò)增到1株陽性菌株。進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行O血清凝集試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，陽性對(duì)照菌與標(biāo)準(zhǔn)O26抗原血清發(fā)生了顯著凝集，陰性對(duì)照菌未發(fā)生凝集，而待測菌株發(fā)生了顯著凝集，表明該菌株確證為O26。結(jié)果顯示，屠宰場120份樣品中僅鑒定出1株O26，該菌株分離自胴體樣品，其他樣品均未檢測到O26。進(jìn)一步計(jì)算胴體中污染率為2.22%(1/45)，總污染率為0.83%(1/120)(表2)。

目前國際上關(guān)于非O157污染調(diào)查已有較多報(bào)道。Bosilevac等[21]調(diào)查發(fā)現(xiàn)5個(gè)牛肉加工廠O26 STEC的檢出率為23.4%。Molini等[22]對(duì)納米比亞屠宰場調(diào)查結(jié)果顯示，O26 STEC的檢出率為10.43%。Svoboda等[16]調(diào)查美國7個(gè)小型和超小型牛肉加工廠，在胴體樣本中的大腸桿菌O26的檢出率為4.9%。在伊朗，340份零售牛肉中O26 STEC的檢出率為3.23%[23]。然而，Arthur等[24]調(diào)查了美國牛肉加工廠，發(fā)現(xiàn)從牛胴體沒有分離到大腸桿菌O26。Thomas等[25]關(guān)于愛爾蘭牛中非O157調(diào)查，亦未從胴體樣品中檢出大腸桿菌O26。近期，本課題組[26]還從49份零售牛肉中分離出2株大腸桿菌O26，陽性率為4.1%。上述報(bào)道結(jié)果并不完全一致，本試驗(yàn)陽性檢出率亦較低，這可能與環(huán)境、飼養(yǎng)、管理、屠宰工藝等多種因素有關(guān)。

2.2 多重PCR檢測毒力基因

大腸桿菌導(dǎo)致人類疾病與其攜帶的毒力基因密切相關(guān)，如stx、eae、hly等[27]，其致病機(jī)理往往是多種毒力因子共同作用的結(jié)果。其中最主要的毒力因子是志賀毒素Stx，包括Stx1和Stx2，研究[28]發(fā)現(xiàn)只產(chǎn)Stx2的菌株相對(duì)于只產(chǎn)Stx1和既產(chǎn)Stx2又產(chǎn)Stx1的菌株具有更強(qiáng)的致病性。由eae基因編碼的緊密素，可引起腸粘膜的“粘附和消除”(attaching and effacing)損傷[29]。hly基因編碼的腸溶血素能夠在宿主靶細(xì)胞膜上形成孔道，進(jìn)而殺死宿主靶細(xì)胞。由eae編碼的緊密素和hly編碼的腸溶血素已被用作致病性STEC的可能流行病學(xué)標(biāo)志物[30-31]。

1. 100 bp ladder Marker 2. 陽性對(duì)照 3. 陽性分離株 4. 空白對(duì)照

圖1 陽性分離株O26血清型的PCR鑒定結(jié)果

Figure 1 PCR amplification forE.coliO26 antigen of one positive isolate

1. 陰性對(duì)照 2. 陽性分離株 3. 陽性對(duì)照

采樣點(diǎn)陽性樣品/總樣本污染率/%地面 0/30.00血水 0/40.00污水 0/80.00工具 0/170.00工人手 0/70.00紅內(nèi)臟 0/160.00白內(nèi)臟 0/160.00胃內(nèi)容物0/20.00胴體 1/452.22肉品殘?jiān)?/20.00總計(jì) 1/1200.83

本試驗(yàn)采用多重PCR方法對(duì)上述大腸桿菌O26陽性分離株檢測其毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)，其中以大腸桿菌O157:H7 CICC21530為陽性對(duì)照，以大腸桿菌DH5α為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖3所示。陽性菌株CICC21530成功擴(kuò)增出了4條陽性條帶，而該陽性分離株未擴(kuò)增出陽性條帶，即它不攜帶上述4種毒力基因。

1. 100 bp ladder Marker 2. 陽性對(duì)照 3. 陰性對(duì)照 4. 陽性分離株 5. 空白對(duì)照

圖3 大腸桿菌O26陽性菌株4種毒力基因多重PCR電泳圖

Figure 3 Multiplex PCR amplification of four virulence genes of the positiveE.coliO26 isolate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)調(diào)查了某牛屠宰場大腸桿菌O26的污染情況，采集的120份樣品僅從牛胴體樣品中分離到1株大腸桿菌O26，陽性率為0.83%，其中胴體檢出率為2.22%。毒力基因的多重PCR結(jié)果顯示該株大腸桿菌O26不攜帶stx1、stx2、eae、hly基因。本試驗(yàn)表明該牛屠宰場大腸桿菌O26的污染水平較低。本次調(diào)查檢出率低且未分離到有毒菌株，可能與調(diào)查樣本小有較大關(guān)系，為了更全面反映中國O26等非O157大腸桿菌污染情況，應(yīng)加強(qiáng)和加大對(duì)該類致病菌的調(diào)查研究，進(jìn)而為中國今后相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂和非O157大腸桿菌的有效監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。