王文珍，王慧慧，陳美雯，徐如飛，蔣培蓉，蒲首丞，鞏菊芳，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

丙酮酸激酶（EC2.7.1.40，PK）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）對核苷二磷酸（NDP）的磷酸化產(chǎn)生核苷三磷酸（NTP）[1-2]和丙酮酸，二價陽離子和核苷酸形成的復(fù)合體是胞內(nèi)蛋白的配體[3-5]。不同物種來源的PK，其反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率1/2時的底物濃度Km（ADP）具有較大差異。如大腸桿菌PKII和蓖麻 PK的 Km（ADP）約為 50 mol/L[6-7]，而人和褐家鼠PK的Km（ADP）均大于 1 mmol/L[8-9]。PK的最適pH大多為中性，而部分植物和剛地弓形蟲的最適pH 在 8.0 左右[6，10-11]。乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27，LDH）催化NADH還原丙酮酸生成乳酸和NAD+及其逆反應(yīng)[12]。Km（NADH），Km（pyruvate），Km（NAD），Km（lactate）在不同的物種中具有很大差別，目前報道最大的Km（lactate）是美洲螯龍蝦LDH的1100mmol/L[13]，而來自惡性瘧原蟲的 Km（lactate）僅為 47 mol/L[14]。LDH的最適pH大多為中性，來自牛[15]和鉤蟲貪銅菌[16]的LDH具有目前報道的最高且最適pH值（9.8）。PK和LDH是生物體內(nèi)糖酵解過程中重要的氧化還原酶[17]，廣泛存在于動植物組織和各種微生物細(xì)胞內(nèi)。通過測定NADH光吸收的變化，可以間接反映丙酮酸濃度的變化，從而可計算出PK以及LDH的酶活[12]。大多數(shù)嗜熱酶在高溫條件下仍然保持很高的催化活性，所以，嗜熱酶是目前研究和開發(fā)最多的酶之一。嗜熱菌是當(dāng)前獲得嗜熱酶最直接和可靠的來源。在浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實驗室的前期工作中，發(fā)現(xiàn)蒼白空氣芽孢桿菌（Aeribacillus pallidus JH-7）為中度嗜熱菌（最適生長溫度為50℃），可分泌抑菌活性物質(zhì)。

本研究克隆并表達嗜熱芽孢桿菌丙酮酸激酶（ApPK）和乳酸脫氫酶（ApLDH），并測定其動力學(xué)常數(shù)，分析其作為工具酶的可行性。

1 材料和方法

1.1 菌株與載體

嗜熱蒼白空氣芽孢桿菌（Aeribacillus pallidus JH-7），菌株 E.coli DH5α 及 BL21（DE3），原核表達載體pET24a，克隆載體pMD19-Tsimple等，均保存于浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實驗室-80℃冰箱。

1.2 酶與生化試劑

還原型輔酶 I（NADH）、氧化型輔酶 I（NAD+）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、三磷酸腺苷（ATP）、鳥苷二磷酸（GDP）、脲苷二磷酸（UDP）、胞苷二磷酸（CDP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸烯醇式丙酮酸、鎳柱親和層析樹脂、溶菌酶、二硫蘇糖醇、丙酮酸、L-乳酸鈉和抑肽素均購自于合肥海伯萊生物技術(shù)有限公司；兔肌肉丙酮酸激酶（OcPK）、兔肌肉乳酸脫氫酶（O-cLDH）購自于羅氏公司；DNA聚合酶，dNTP Mixture，BamH I，Sal I，EcoR I，Not I，Xho I等限制性內(nèi)切酶購自于杭州皓豐生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（CW0552S）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 嗜熱菌pk和ldh基因克隆 參照細(xì)菌基因組提取試劑盒的使用說明，提取ApJH-7基因組，并保存于-20℃以及參考貢莎莎等[18]的原核表達載體構(gòu)建。以所提基因組為模板，利用PCR擴增Appk（pkF：ACGCGTCGACCCATGCGAAAAACGAA；pkR：ATAAGAATGCGGCCGCCTCGAGTAGAACG）和 Apldh（ldhF：CCACGCGGATCCGAATTCATGAAT AAAGA；ldhR：ACGCGTCGACAATGACAGATTTCA TCGTAT）。將純化的 PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T simple載體，通過熱激法轉(zhuǎn)入 E.coli，DH5α。提取經(jīng)測序驗證含Appk和Apldh的質(zhì)粒載體，雙酶切相應(yīng) Appk（Sal I和 Not I）和 Apldh（BamH I和 Sal I）載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后分別連接到表達載體pET24a構(gòu)建重組表達載體PK-pET24a，LDH-pET24a。分別轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得ApPK和ApLDH的表達菌株。

1.3.2 ApPK和ApLDH的表達、純化 參照李鴻艷等[7]和賀飛燕等[19]的方法，將表達菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝0.6，加0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達（37℃，220 r/min，3 h）；離心收集菌體進行裂解、破碎、高速離心后收集上清液。經(jīng)鎳柱咪唑梯度親和層析，再經(jīng)SDS-PAGE鑒定含有目的蛋白的組分，合并含高純度目的蛋白組分，進行透析（50 mmol/L Hepes，pH 值 8.0）。所得目的蛋白經(jīng) Bradford 法[20]測定蛋白濃度后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ApLDH活性測定 利用分光光度法（瓦里安UV4000，安捷倫）測定LDH酶活[12]?；钚詼y定原理為LDH催化NADH的氧化或者NADH的生成，根據(jù)NADH在339 nm光吸收的變化可計算出LDH的活性。為分析ApLDH的最適pH，測定條件為：0.1 mmol/L NADH，0.065 μmol/L ApLDH，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值分別為 5.2，5.4，5.6，5.8，6.2，6.4，6.6），用 0.9 mmol/L丙酮酸起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為35℃。為分析ApLDH的溫度穩(wěn)定性，ApLDH經(jīng)不同溫度（30，40，50，52，54，55，56，58，60 ℃）處理45 min后，冷卻至室溫，進行活性測定。條件為：0.1 mmol/L NADH，0.065 μmol/L ApLDH，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0），反應(yīng)溫度為35℃。為分析其最適反應(yīng)溫度，利用0.1mmol/LNADH，0.065 μmol/L ApLDH和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0），不同的反應(yīng)溫度（30，32，34，36，38，40 ℃），進行ApLDH酶活測定。為測定ApLDH的動力學(xué)常數(shù)，固定一個底物濃度為10倍Km，改變另一個底物濃度，在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0）和35℃條件下測定其反應(yīng)活性，所得數(shù)據(jù)利用米氏方程v＝Vmax×[s]/（Km＋[s]）（其中，Vmax表示最大反應(yīng)速率；[s]表示底物濃度）進行擬合，得Vmax及Km。

1.3.4 ApPK活性測定 利用分光光度法和OcLDH為偶聯(lián)酶測定ApPK酶活[12]。PK活性測定原理為PK催化NDP的磷酸化生成NTP和丙酮酸，產(chǎn)物之一丙酮酸可被LDH還原為乳酸，同時NADH被氧化為NAD+。根據(jù)在339 nm光吸收變化可計算出PK活性產(chǎn)物之一丙酮酸的生成速度。為分析其最適pH值，活性測定條件為：50 mmol/LMgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/LADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mL OcLDH，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值分別為5，6，7，8，9），利用 1.5 mmol/LPEP 起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40℃。為分析其溫度穩(wěn)定性，ApPK經(jīng)不同溫度（30，40，50，55，60，65，70 ℃）處理 45 min，冷卻至室溫，進行活性測定。測定條件為：50 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/L ADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mLOcLDH，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH＝8.0），利用1.5 mmol/L PEP起始反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40℃。為分析其最適反應(yīng)溫度，利用50mmol/LMgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/L ADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mL OcLDH，1.5 mmol/L PEP，50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH＝8.0），不同的反應(yīng)溫度（40，45，50，55，60℃），進行ApPK酶活測定。為測定ApPK對NDP的磷酸化，利用最適的pH，溫度為45℃，其他條件為測定最適pH時的條件，改變NDP濃度測定其酶活，所得數(shù)據(jù)利用米氏方程擬合，得Vmax及Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌pk和ldh基因克隆及蛋白表達純化

PCR法擴增Appk和Apldh，其產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，可見擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖1，2）。經(jīng)酶切驗證及測序驗證表明載體構(gòu)建成功。經(jīng)表達菌株BL21（DE3）的誘導(dǎo)表達、鎳柱梯度親和層析，純化分別獲得分子量為65 ku的ApPK（圖3）和35 ku的 ApLDH（圖 4）。

2.2ApPK和ApLDH的最適pH分析

pH對酶的活性有較大影響。利用不同pH緩沖液分析ApPK和ApLDH活性，結(jié)果表明，ApPK的最適pH值為8.0，高于8.0會導(dǎo)致活性急劇下降，且pH值低于6.0時酶活性降至最大活性的1%左右；ApLDH的最適pH值為5.8，且酸性條件更加容易導(dǎo)致其活性下降（圖5）。

2.3 ApPK和ApLDH的最適反應(yīng)溫度分析

溫度對酶的活性也有較大影響。利用不同反應(yīng)溫度分析ApPK和ApLDH活性，結(jié)果表明，其活性受溫度影響呈典型的鐘型曲線（圖6）。ApPK和ApLDH的最適溫度分別為 50，35℃，ApPK在ApLDH的最適溫度處的活性為最大活性的60%～70%，而ApLDH在ApPK最適溫度處的活性為最大活性的62%，相對來說，其活性還是很高的。

2.4 不同陽離子對ApPK和ApLDH活性的影響

利用 2mmol/L的 Mn2+或 Mg2+，20mmol/L的 Li+，200mmol/L的K+或Na+的陽離子（一價陽離子的測定體系中Mg2+濃度為34mmol/L），分析了其對ApPK和ApLDH活性的影響。結(jié)果表明，Mn2+，Mg2+對ApLDH的活性影響較小，而極大的促進了ApPK的活性，且Mg2+促進作用強于Mn2+（除特別說明，本研究中ApPK活性測定體系均含有Mg2+）。Na+，K+和Li+對ApPK的活性具有抑制作用，Li+抑制效應(yīng)最大，K+抑制效應(yīng)最小。Na+抑制ApLDH的62%活性，Li+，K+抑制其 50%左右的活性（表 1）。

表1 陽離子對ApPK和ApLDH活性的影響

2.5 ApPK和ApLDH的動力學(xué)常數(shù)分析

LDH在胞內(nèi)催化丙酮酸還原為乳酸。改變底物濃度測定其活性，經(jīng)米氏方程擬合，發(fā)現(xiàn)ApLDH的Km（lactate）高達26.2 mmol/L，而其最適底物為NADH（Km（NADH）為 34.3 μmol/L），最大反應(yīng)速度kcat為12.7 s-1（表2）。

表2 ApLDH的動力學(xué)常數(shù)

表3 ApPK對NDP磷酸化的動力學(xué)常數(shù)

PK在胞內(nèi)催化NDP磷酸化生成相應(yīng)的NTP。改變NDP濃度，測定ApPK動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其最適底物為GDP，其Km為1.6 mmol/L。催化效率最高的為底物ADP（Kcat/Km為5×104mol/（L·s）），最低為CDP（4.0×103mol/（L·s））（表3），不同NDP的催化效率Kcat/Km比較結(jié)果為ADP＞GDP＞UDP＞CDP，且均低于大腸桿菌和兔肌肉PK（表3）。

2.6 ApPK和ApLDH的熱穩(wěn)定性分析

ApLDH經(jīng)30～50℃處理其活性穩(wěn)定，在50～52℃時酶活急劇下降，60℃時基本已失活。ApPK經(jīng)30～50℃處理其活性穩(wěn)定，基本不受溫度影響，超過58℃后，其活性急劇下降（圖7）。

3 結(jié)論與討論

偶聯(lián)酶法作為測定酶活的方法被廣泛運用。而丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶通常作為偶聯(lián)酶，在20～37 ℃測定 NDP 的產(chǎn)生[2，3，7，12]。本研究從嗜熱菌中克隆表達ApPK和ApLDH，可以在高溫下應(yīng)用于NDP的生成酶的活性分析，以期分離鑒定能夠承受更高溫度的嗜熱酶，并分析酶的活性。

本研究成功表達、純化了ApPK和ApLDH，并分析了不同pH、溫度、陽離子對其活性的影響。結(jié)果表明，ApPK最適pH值為8.0，與植物和剛地弓形蟲PK最適pH類似；ApLDH最適pH值為5.8，與嗜熱脂肪土芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌LDH最適pH類似[22-23]。2 mmol/L二價陽離子對ApLDH活性有輕微的抑制作用，而二價陽離子是ApPK活性必需的，此結(jié)果也說明核苷酸與二價陽離子形成的復(fù)合物是激酶的底物。高于60℃的溫度對ApPK和ApLDH具有強烈滅活作用。

本研究表明，ApPK和ApLDH活性的最適溫度分別為50，35℃，有意思的是，Aeribacillus pallidus JH-7的最適生長溫度為50℃，此溫度雖然不是ApLDH的最適溫度，但是活性還是自身最大活性的62%，kcat為16.4 s-1，因此，確定在此溫度下可以作為偶聯(lián)酶。