鞠厚斌，楊德全，葛菲菲，劉 健，李 鑫，楊顯超，齊新永，鄧 波，王 建，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科中的偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性多種動物共患傳染病[1]。本病在世界范圍內普遍流行，目前已有50多個國家和地區(qū)報道發(fā)生PR。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展和強毒株的出現(xiàn)，PR 的發(fā)生和流行日趨嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失，已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一。

從國內流行范圍上看，PR流行范圍很廣，遍及 24 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），特別是隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)模化發(fā)展，本病有逐漸擴大和蔓延的趨勢，但沒有發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)，多呈散發(fā)流行。從發(fā)病年齡上看，以繁殖母豬和仔豬為主，2 周齡以內仔豬的發(fā)病率和死亡可高達100%，斷奶仔豬的發(fā)病率為20%～40%，死亡率為10%～20%，養(yǎng)豬密集地區(qū)的發(fā)病率較高[2]。2012 年以來，PRV變異毒株在全國范圍內流行，給PR凈化和預防帶來了新的壓力，也給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了慘重損失[3]。為了解上海市定點監(jiān)測豬群的PRV感染情況，應用熒光PCR方法開展病原學調查，并分離鑒定地方流行毒株，以期為制訂合理的PR防控與凈化策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2014—2015年，采集上海市1個獸醫(yī)疾病診斷中心、14個種豬場、8個規(guī)模豬場、3個屠宰場定點監(jiān)測豬群的內臟、扁桃體、頜下淋巴結、血清、唾液、精液等樣品，共1 863份（表1）。不同種類樣品來源于不同豬只，采集后-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

PRV抗體陰性的6月齡健康家兔6只：購自上海丙干寵物有限公司。

1.3 主要試劑

核酸提取試劑盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit ：購自QIAGEN 公司；PRV熒光PCR試劑盒：購自北京生科尚儀生物科技有限公司；BHK-21細胞株：上海市動物疫病預防控制中心保存；DMEM和胎牛血清：購于Thermo公司。

表1 2014—2015年上海市定點監(jiān)測豬群PR病原學檢測的樣品來源與數(shù)量

1.4 核酸提取及熒光PCR 檢測

參照核酸提取試劑盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit說明提取病毒核酸，按照北京生科尚儀生物科技有限公司的PRV熒光PCR試劑盒說明書進行核酸檢測。

1.5 病毒分離與鑒定

1.5.1 病料處理 將無菌采集的病死豬淋巴結、脾臟等組織研磨，用PBS制成1∶10的組織懸液，加入適量青霉素、鏈霉素處理后，反復凍融3次，4 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 病毒的細胞培養(yǎng) 將病料懸液上清液接種于BHK-21單層細胞，盲傳3代，觀察有無細胞病變。待細胞病變達80%左右時收獲病毒液，經3 次反復凍融，4 000 r/min離心10 min，取上清液接種細胞進行病毒克隆純化及病毒蝕斑計算。

1.5.3 熒光PCR方法鑒定 按照北京生科尚儀生物科技有限公司的PRV熒光PCR試劑盒說明書進行檢測。

1.5.4 間接免疫熒光抗體試驗（IFA） 將2 mL BHK-21細胞懸浮液加入腔式載玻片，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h；棄掉原細胞培養(yǎng)液，用無菌PBS洗3次，再加入1 mL PCR檢測陽性的病毒液； 37 ℃溫箱作用1 h后，吸掉病毒液，加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄掉維持液，再用PBS洗3次，然后用預冷丙酮固定腔式載玻片上的細胞培養(yǎng)物；用PBS洗滌3次，加入500 μL 1∶100稀釋的PRV單抗，37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次后，同F(xiàn)ITC標記的兔抗鼠IgG抗體37 ℃孵育30 min；最后用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察。同時設置加入PBS的細胞培養(yǎng)物作陰性對照。

1.5.5 毒價測定 取5、10、15、20代病毒培養(yǎng)物，經10倍系列稀釋，取100 μL接種到96 孔細胞培養(yǎng)板；每個稀釋度設4個孔，觀察細胞病變產生情況，按照Reed-Muench 法計算半數(shù)細胞感染量（TCID50）[4]。

1.5.6 家兔接種試驗 將6只實驗家兔隨機分為2組（試驗組4只、對照組2只）；將分離的病毒稀釋至103.0TCID50/0.1 mL，然后接種于實驗組家兔后頸部皮下，接種劑量為0.2 mL/只，對照組同部位注射生理鹽水，觀察家兔接種后的臨床癥狀。

2 結果與分析

2.1 病原學檢測

2014年共檢出39份PRV核酸陽性，總陽性率為4.3%（39/898），分離出10株PRV毒株；2015年共檢出9份PRV核酸陽性，總陽性率為0.9%（9/965），共分離出2株PRV毒株。從檢測結果（表2）可以看出，PRV核酸陽性檢出率呈現(xiàn)大幅下降趨勢。

表2 2014—2015年PR病原學檢測結果

2.2 病毒分離鑒定

2.2.1 病毒細胞培養(yǎng)及熒光PCR鑒定 細胞接毒后12～48 h，出現(xiàn)細胞病變：細胞單層出現(xiàn)雙折光性細胞，并逐漸增多，然后完全脫落，形成合胞體，其形態(tài)和大小各異（圖1）。PRV熒光PCR試劑盒檢測結果顯示，2014年分離的10株和2015年分離的2株病毒呈典型的S型擴增曲線，證實為PRV。

2.2.2 病毒蝕斑計算 經過3 次篩選，在稀釋倍數(shù)為10-6的細胞單層上可見較小的單個空斑；4個孔的空斑個數(shù)分別為5、3、4、6，共18 個。挑取單個空斑繼續(xù)在BHK-21 細胞上傳代，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)典型細胞病變的時間穩(wěn)定在接種后16 h 左右（圖2）。按沈強等[3]的方法計算0.1 mL 的空斑形成單位（PFU）為4.0×10-5。

圖1 BHK-21細胞病變

圖2 病毒蝕班

2.2.3 BHK-21細胞間接免疫熒光抗體（IFA）鑒定 病料接種BHK-21細胞的IFA檢測結果顯示，細胞胞漿和胞核呈現(xiàn)明顯的特異熒光（圖3-A），證明病毒液接種細胞能與PRV單抗特異性結合，表明所分離的毒株為PRV，而未接種的BHK-21細胞未見綠色熒光（圖3-B）。

圖3 BHK-21細胞間接免疫熒光抗體（IFA）鑒定結果

2.2.4 病毒毒價測定 將分離到的1株病毒接種到BHK-21細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)20 代，每隔5 代取樣測定病毒滴度，發(fā)現(xiàn)滴度分別為10-4.8、10-5.0、10-5.3、10-5.6TCID50/0.1 mL，表明病毒分離初期毒價較低，經細胞傳代，毒價有所提高，至第20 代，病毒滴度穩(wěn)定在10-5.6TCID50/0.1 mL。

2.2.5 家兔接種試驗 4只家兔接種病料稀釋液24 h后，表現(xiàn)精神沉郁、發(fā)熱、呼吸加快，并出現(xiàn)局部奇癢癥狀，用力撕咬接種點，引起局部脫毛、皮膚破損出血，嚴重者出現(xiàn)角弓反張，4～6 h后衰竭而亡（圖5）。對照組家兔不表現(xiàn)臨床癥狀。

3 討論

圖5 家兔接種試驗

2014—2015年，上海市定點監(jiān)測豬群中共檢出48份PRV核酸陽性，總陽性率為2.6%（48/1 863），2015年的PRV核酸陽性率較2014年大幅下降。從本中心實驗室2006年以來的檢測數(shù)據(jù)看，2009年后PR在本市定點監(jiān)測豬群中病原學陽性率直線上升，至2013年達到31.1%，2014年以后陽性率快速回落，2015年達到最低水平。分析其原因：一是前兩年PRV變異株的流行對大多數(shù)養(yǎng)殖場造成了很大損失，養(yǎng)殖場普遍加強了PR免疫，對該病的防控意識進一步加強；二是上海市自2015年開始，開展了大規(guī)模的退養(yǎng)和整治措施，取締了周邊所有散養(yǎng)戶和大部分中小規(guī)模養(yǎng)豬場，只保留了大型規(guī)模場和種豬場。

2014—2015年診斷中心檢出29份PRV核酸陽性樣品，占比60.42%（29/48），分析其原因可能與診斷中心的樣品主要來源于病死豬有關。2015年的4份內臟陽性樣品分別來源于4個規(guī)模豬場。經調查，這4家規(guī)模豬場未從2014年精液陽性種豬場引進豬只，不存在流行病學關聯(lián)。上述情況表明，這4家規(guī)模豬場可能存在PRV野毒感染。

2014年檢出的39份PRV核酸陽性樣品中，有15份來自種公豬精液，2015年采集的78份精液中未檢出PRV核酸陽性，表明種豬場通過加強PR凈化和淘汰陽性種豬取得了良好的防控效果。攜帶PRV的種公豬基本不表現(xiàn)臨床癥狀，但可通過引種和人工授精方式將疫病傳給生產母豬，導致母豬發(fā)生流產、難產等繁殖障礙癥狀，會給養(yǎng)殖場帶來嚴重的疫情威脅和經濟損失[5]。因此，及時淘汰陽性種公豬顯得尤為重要。通過檢測，及時督促種豬場淘汰隱性帶毒種公豬，是做好種公豬PR凈化的關鍵，也可為種豬場PR凈化方案的制定提供依據(jù)。

將采集的樣品處理后接種BHK-21細胞增殖，通過觀察特異性細胞病變，以及熒光PCR、IFA及動物接種試驗，共分離鑒定出12株流行毒株，并對其中1株毒株進行了病毒毒價測定，獲得了穩(wěn)定的毒價，這為進行下一步的動物試驗奠定了良好的基礎。