楊小林，韓 燁，殷得所，張瑞洋，張佑宏，張 舒

(1.農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；2.武漢市江夏區(qū)農(nóng)業(yè)局，湖北 武漢 430200； 3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，湖北 武漢 430064；4.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068； 5.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北 武漢430064)

水稻穗腐病(Rice spikelet rot disease，RSRD)，又名穎枯病、黑穗病、褐變穗病[1]或谷霉斑病、谷斑點(diǎn)病等[2]，病害初期時(shí)，穎殼上出現(xiàn)黃褐色病斑，后期病斑擴(kuò)展至整個(gè)谷粒，谷粒變成黑褐色或黑色，穗部表面覆蓋白色或黑色霉層，米?；位蜃兩?，結(jié)實(shí)率下降，癟粒多，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。目前國內(nèi)多地有該病害的報(bào)道，學(xué)者們圍繞引起病害的病原真菌進(jìn)行了廣泛研究[3-5]，包括病原真菌的鑒定和生物學(xué)特性的研究，以期對(duì)水稻穗腐病的病因有明確了解，從而增強(qiáng)對(duì)病害的有效控制，減少其流行和危害的發(fā)生。

湖北地處華中，氣候適宜，稻瘟病和稻曲病是水稻的重要病害[6-7]，近年在湖北的主要稻區(qū)零星發(fā)現(xiàn)穗腐病。為防患于未然，于田間采集病穗標(biāo)本，開展湖北稻區(qū)穗腐病病原菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究，為該病害的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試標(biāo)樣 2015—2016年在湖北省東南稻區(qū)采集穗腐病標(biāo)樣，分別記錄、裝袋，置于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存，以待分離。

1.1.2 水稻品種 利用水稻品種晚秈98進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。晚秈98是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的秈型晚稻品種，田間高感稻瘟病，易感稻曲病。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

查氏培養(yǎng)基(CDA培養(yǎng)基)：硝酸鈉 3 g、磷酸氫二鉀 1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g、水1 000 mL。

1.2.2 病原菌的分離和柯赫氏法則驗(yàn)證 參照方中達(dá)[8]方法進(jìn)行穗腐病病原菌的分離與純化。將獲得的菌株于水稻揚(yáng)花期進(jìn)行針刺接種，以注射清水為對(duì)照，7 d后調(diào)查結(jié)果并分別取樣、分離、培養(yǎng)，完成病原菌柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.3 病原菌的ITS鑒定 參照HE[9]的方法提取病原菌基因組DNA。利用真菌ITS鑒定通用引物ITS4和ITS5對(duì)分離獲得的病原菌進(jìn)行ITS-PCR鑒定[10]。通過PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得病原真菌ITS序列，與GenBank中的序列進(jìn)行BLAST分析。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由武漢天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.2.4 生物學(xué)特性研究 生物學(xué)特性研究采用菌絲生長速率法[11-12]。用直徑5 mm的打孔器切取病原菌的菌餅，轉(zhuǎn)至系列處理的PDA培養(yǎng)基平板(不同溫度、不同瓊脂含量、不同酸堿度)或查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基平板上，7 d 時(shí)用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用DMRT法[13]對(duì)病原菌生物學(xué)特性的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻穗腐病病原菌的菌落形態(tài)特征

2015—2016年從湖北省東南稻區(qū)采集感病標(biāo)本，病穗上有褐色病斑，小穗枯黃，籽粒干癟或霉?fàn)€，病穗與苞葉間充滿白色菌絲體，籽粒間可見灰白色菌絲體(圖1)。采用植物病理學(xué)組織分離方法，從感病谷粒上分離、純化獲得外形特征有區(qū)別的5株菌，分別記為菌Ⅰ、菌Ⅱ、菌Ⅲ、菌Ⅳ、菌Ⅴ。在PDA培養(yǎng)基上，菌Ⅰ菌落為白色，圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，蓬松，邊緣整齊；菌Ⅱ菌落為灰褐色，平整，邊緣整齊；菌Ⅲ菌落初為灰白色，后變?yōu)榛液谏?，圓形，平整，邊緣整齊；菌Ⅳ菌落深褐色，圓形，周緣整齊；菌Ⅴ菌落為黑色，松軟，生長速度快(圖2)。

圖1 水稻穗腐病的田間采樣標(biāo)本Fig.1 Sampling specimens of RSRD in field

A.菌Ⅰ；B.菌Ⅴ；C.菌Ⅱ；D.菌Ⅲ；E.菌Ⅳ

2.2 水稻穗腐病病原菌的ITS鑒定

為鑒定試驗(yàn)中分離獲得的菌株與已知病原真菌的異同，并確定其科學(xué)分類地位，利用PCR技術(shù)對(duì)分離獲得的5個(gè)菌株的ITS序列進(jìn)行了擴(kuò)增(圖3)并測(cè)序，5段序列的大小介于529～544 bp。與GenBank中已登錄的序列進(jìn)行比對(duì)分析，菌Ⅰ與嶺南聚孢霉(Clonostachyepichloe，登錄號(hào)為JN198444.1)的ITS序列相似性達(dá)99%；菌Ⅱ—Ⅳ與稻毛錐孢(Alternariapadwickii，登錄號(hào)為GU373650.1)的ITS序列相似性達(dá)到99%；菌Ⅴ與稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae，登錄號(hào)為KU254608.1)的ITS序列相似性達(dá)99%。

結(jié)合菌落形態(tài)和ITS序列分析，分離獲得的5個(gè)菌株被分為3類：菌Ⅰ為一類菌，被鑒定為子囊菌亞門(Ascomycota)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)生赤殼科(Bionectriaceae)螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)嶺南聚孢霉(Clonostachyepichloe)，有性態(tài)為Bionectriaepichloe；菌Ⅱ—Ⅳ屬于同一類菌，被鑒定為盤菌亞門(Pezizomycotina)座囊菌綱(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)格孢菌科(Pleosporaceae)鏈格孢屬(Alternaria)稻毛錐孢(Alternariapadwickii)；菌Ⅴ為一類菌，被鑒定為盤菌亞門(Pezizomycotina)糞殼菌綱(Sordariomycetes)假毛球殼目(Trichosphaeriales)假毛球科(Trichosphaeriaceae)黑孢屬(Nigrospora)稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)。據(jù)此，采用菌Ⅰ、菌Ⅳ和菌Ⅴ完成后續(xù)研究。

M：DL 2000 marker；Ⅰ—Ⅴ:菌Ⅰ—Ⅴ的PCR產(chǎn)物

2.3 水稻穗腐病病原菌的柯赫氏法則驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定分離、純化獲得的3類菌株(菌Ⅰ、菌Ⅳ和菌Ⅴ)是否為引起水稻穗腐病的病原真菌，依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行了驗(yàn)證。把制備好的菌液采用注射接種法于水稻揚(yáng)花期進(jìn)行人工接種，7 d后調(diào)查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相比健康的對(duì)照植株，菌株接種后稻株出現(xiàn)癥狀。菌Ⅰ處理的穗部變?yōu)榘咨?，菌Ⅳ處理的穗部出現(xiàn)灰褐色，菌Ⅴ處理的穗部明顯變黑(圖4)。分別采樣后進(jìn)一步分離、純化，獲得的菌株生長性狀與接種病菌一致，因此，確定菌Ⅰ、菌Ⅳ和菌Ⅴ均是引起田間水稻穗腐的病原真菌。

A—D依次為對(duì)照、菌Ⅰ、菌IV、菌V接種后癥狀

2.4 水稻穗腐病病原菌的生物學(xué)特性研究

2.4.1 溫度對(duì)病原菌生長的影響 試驗(yàn)設(shè)定5、15、25、35、40 ℃等5個(gè)溫度處理，以25 ℃溫度處理作為對(duì)照，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后利用十字交叉法分別調(diào)查菌落的直徑大小。結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度對(duì)菌Ⅰ、菌Ⅳ和菌Ⅴ 3類菌的生長均有影響，且存在差異(圖5)。極端低溫5 ℃時(shí)，菌Ⅰ的生長出現(xiàn)停滯，菌Ⅳ和菌Ⅴ的生長速度緩慢；極端高溫40 ℃時(shí)，3類菌的生長均停止，表明極端低溫和極端高溫均不利于病原菌的生長。方差分析的結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，3類菌的菌落直徑均顯著高于其他4個(gè)溫度處理。

小、大寫字母分別表示同一類菌的不同處理在0.05、0.01水平上差異顯著或極顯著，下同

2.4.2 培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度對(duì)病原菌生長的影響 為研究培養(yǎng)基中瓊脂含量對(duì)病原菌生長的影響，將培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度依次設(shè)置為10、15、20、25、30 g/L。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，利用十字交叉法分別調(diào)查菌落的直徑大小。3類菌在不同瓊脂含量的培養(yǎng)基上生長情況有差異。對(duì)于菌Ⅰ，15～30 g/L瓊脂處理之間的菌落直徑有差異但沒有達(dá)到顯著水平，它們與10 g/L瓊脂處理菌落直徑的差異達(dá)到極顯著水平。對(duì)于菌Ⅳ，20～30 g/L瓊脂處理之間的菌落直徑?jīng)]有顯著差異，它們與10 g/L處理有顯著差異，與15 g/L處理有極顯著差異。對(duì)于菌Ⅴ，相同時(shí)間內(nèi)生長最快的是10 g/L瓊脂處理，菌落直徑與其余各處理存在極顯著差異，15～25 g/L瓊脂處理之間的菌落直徑無顯著差異，這3個(gè)處理與30 g/L處理的菌落直徑有顯著差異(圖6)。結(jié)果表明，3類菌培養(yǎng)基最佳的瓊脂質(zhì)量濃度不盡相同，菌Ⅰ最適宜生長的瓊脂質(zhì)量濃度為20 g/L；菌Ⅳ在培養(yǎng)基的瓊脂質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)表現(xiàn)出最快的生長勢(shì)頭；最適菌Ⅴ生長的瓊脂質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖6 培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度對(duì)水稻穗腐病病原菌生長的影響Fig.6 Effect of agar mass concentration in medium on the growth of pathogenic fungi causing RSRD

2.4.3 氮源對(duì)病原菌生長的影響 試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)氮源處理，分別以大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、硫酸銨、尿素、黃豆粉、甘氨酸等7種物質(zhì)作為不同的氮源代替硝酸銨，以查氏培養(yǎng)基中3 g/L硝酸銨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別稱取和查氏培養(yǎng)基中相等含氮量的氮源物質(zhì)制備培養(yǎng)基，研究不同氮源物質(zhì)對(duì)病原菌生長的影響。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，利用十字交叉法分別調(diào)查菌落的直徑大小。結(jié)果表明，同一類菌在不同氮源培養(yǎng)基上的生長速度存在差異，同一氮源培養(yǎng)基上不同菌的生長速度也不盡相同，最適宜菌Ⅰ生長的氮源為硝酸銨，最適宜菌Ⅳ生長的氮源為黃豆粉，最適宜菌Ⅴ生長的氮源為黃豆粉和甘氨酸，在以尿素為氮源時(shí)3類菌的生長均表現(xiàn)停滯(圖7)。

2.4.4 碳源對(duì)病原菌生長的影響 試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)碳源處理，分別以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、山梨醇、甘露醇、羧甲基纖維素鈉等7種物質(zhì)作為不同的碳源代替蔗糖，以查氏培養(yǎng)基中30 g/L蔗糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別稱取和查氏培養(yǎng)基中相等含碳量的碳源物質(zhì)制備培養(yǎng)基，研究不同碳源物質(zhì)對(duì)病原菌生長的影響。結(jié)果表明，同一類菌在不同碳源培養(yǎng)基上生長有差異，不同類菌在同一碳源培養(yǎng)基上的生長同樣存在差異，但3類菌的最適宜碳源均是甘露醇(圖8)。

2.4.5 酸堿度對(duì)病原菌生長的影響 試驗(yàn)設(shè)置5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、9.5共8個(gè)梯度的pH值，以研究病原菌生長最適宜的酸堿度。結(jié)果表明，3類菌在相同pH值的培養(yǎng)基上生長狀況不同，同類菌在不同pH值的培養(yǎng)基上生長也表現(xiàn)出差異(圖9)。菌Ⅰ最適合生長的pH值為9.5，菌Ⅳ最適合的pH值為8.0，而菌Ⅴ的生長情況并未隨著pH值的變化而發(fā)生明顯改變，可見菌Ⅴ是一種pH值適應(yīng)范圍很廣的菌。

圖7 不同氮源對(duì)水稻穗腐病病原菌生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen source on the growth of pathogenic fungi causing RSRD

圖8 不同碳源對(duì)水稻穗腐病病原菌生長的影響Fig.8 Effect of different carbon source on the growth of pathogenic fungi causing RSRD

圖9 不同pH值對(duì)水稻穗腐病病原菌生長的影響Fig.9 Effect of different pH values on the growth of pathogenic fungi causing RSRD

3 結(jié)論與討論

近年穗腐病的發(fā)生在各地稻區(qū)呈上升趨勢(shì)[14]，湖北稻區(qū)雖然是零星發(fā)病，但未雨綢繆，本研究采集標(biāo)本并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，獲得了3類菌株：菌Ⅰ被鑒定為嶺南聚孢霉(Clonostachyepichloe),有性態(tài)為Bionectriaepichloe；菌Ⅳ被鑒定為稻毛錐孢(Alternariapadwickii)；菌Ⅴ被鑒定為稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)。對(duì)此3類菌的生物學(xué)特性開展研究，溫度(5～40 ℃)對(duì)病菌生長影響的研究結(jié)果表明，3類菌的最適宜生長溫度均為25 ℃，而且以最適溫度為中心向兩側(cè)溫度轉(zhuǎn)變，3類病原菌的生長表現(xiàn)出不同程度的抑制，極端低溫和極端高溫下3類菌的生長幾乎停止。培養(yǎng)基中最適瓊脂含量的研究結(jié)果表明，菌Ⅰ最適宜的瓊脂質(zhì)量濃度為20 g/L，菌Ⅳ為25 g/L，菌Ⅴ為10 g/L。通過改變pH值(5.0～9.5)研究病菌的最佳酸堿環(huán)境，發(fā)現(xiàn)菌Ⅰ和菌Ⅳ培養(yǎng)基pH值的改變會(huì)影響菌落的生長，2類菌生長的最佳環(huán)境均偏堿，而菌Ⅴ的生長不受pH值的影響。最適氮源和碳源的研究結(jié)果表明，菌Ⅰ生長最適宜的氮源為硝酸銨，菌Ⅳ為黃豆粉，菌Ⅴ為黃豆粉和甘氨酸，3類菌的最適碳源均是甘露醇。穗腐病害病原真菌的鑒定與分類，以及生物學(xué)特性的分析，為該病害的進(jìn)一步研究提供了必要的理論依據(jù)。

學(xué)者們通過研究發(fā)現(xiàn)，浙江稻區(qū)穗腐病的病原真菌有4類，即層出鐮刀菌、澳大利亞平臍蠕孢菌、新月彎孢菌和細(xì)交鏈孢菌[4,15]；新疆稻區(qū)穗腐病的樣中也分離到3類真菌，主要致病菌是層出鐮刀菌，次要致病菌為新月彎孢菌和細(xì)交鏈孢菌[16]；黑龍江稻區(qū)穗腐病樣中也分離到3類真菌，分別是鏈格孢菌、鐮孢菌和青霉菌，其中鏈格孢菌是致病菌，鐮孢菌和青霉菌未致病[17]。本研究中湖北稻區(qū)穗腐病的病原真菌有3類，通過注射接種菌Ⅳ稻毛錐孢和菌Ⅴ稻黑孢菌，水稻小穗出現(xiàn)典型的穗腐病癥狀，其中菌Ⅳ稻毛錐孢與細(xì)交鏈孢菌同屬鏈格孢屬真菌，表明浙江、新疆、黑龍江、湖北稻區(qū)的穗腐病存在相同屬的病原真菌。同時(shí)多地稻區(qū)穗腐病病原真菌的鑒定結(jié)果證明，引起穗腐病的病原真菌不是單一的而是具有多樣性[14]。以上研究結(jié)果不僅表明鑒定穗腐病病原真菌的必要性，而且預(yù)示了田間病害防控的復(fù)雜性。各地穗腐病害分離菌株生物學(xué)特性的研究表明，不同的分離菌株對(duì)溫度、pH值的適應(yīng)性以及在不同碳、氮源的選擇上存在差異。

除了引起穗腐病多樣性的病原真菌，稻蝽象取食谷粒造成谷粒傷口、引起病菌的侵入，以及穎殼伯克氏菌的存在，是引起谷斑或谷霉的另外2個(gè)重要原因[2]，其中穎殼伯克氏菌的存在易造成細(xì)菌性谷枯病害遠(yuǎn)距離傳播與發(fā)生。針對(duì)谷斑病或谷霉病的病因，利用化學(xué)藥劑可以開展對(duì)穗腐病病原真菌和稻蝽象的有效控制，同時(shí)利用頻振式殺蟲燈[18]以及對(duì)環(huán)境友好無害的信息素或生物菌劑[19-20]，是進(jìn)行稻蝽象和穎殼伯克氏菌防治的另一途徑。通過綜合使用各種防治手段，達(dá)到有效控制谷斑病或谷霉病的目的，實(shí)現(xiàn)糧食的安全生產(chǎn)。

致謝：感謝湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所薛敏峰博士在測(cè)序結(jié)果分析中給予的無私幫助！