劉復(fù)生

(中牟縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南 中牟 451450)

山羊隱孢子蟲病是由隱孢子蟲(Cryptosporidium)感染山羊所引起的一種腸道腹瀉性寄生蟲病，可導(dǎo)致患畜出現(xiàn)腹瀉、消瘦、食欲不振等臨床癥狀，患畜往往因隱孢子蟲的感染而繼發(fā)其他疾病，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。隱孢子蟲于1907年首次在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)并命名，至今已發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲有27個種，超過70個基因型，可寄生于哺乳動物(包括人類)、鳥類等多種動物腸道內(nèi)，引起嚴(yán)重的寄生蟲病[3-4]。隱孢子蟲病的傳播有多種途徑，它可以通過食物、飲水、空氣進(jìn)行傳播，宿主因攝入含有隱孢子蟲蟲卵的糞便、水或食物而感染該病，隱孢子蟲病一旦在養(yǎng)殖場中發(fā)生，便難以根除。因此，隱孢子蟲病的流行給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)者的健康造成了巨大威脅[5]。

可感染山羊或綿羊的隱孢子蟲種類較多，且部分蟲種可感染人類，如微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、豬隱孢子蟲(Cryptosporidiumsuis)等[6-7]。宋軍科等[8]對陜西黑山羊隱孢子蟲病的相關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，該地區(qū)山羊隱孢子蟲感染率為14.0%，且蟲種為肖氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumxiaoi)和牛隱孢子蟲(Cryptosporidiumbovis)；PENG等[9]對河南和陜西的山羊進(jìn)行隱孢子蟲感染調(diào)查，結(jié)果顯示，山羊隱孢子蟲檢出率為16.5%，為微小隱孢子蟲感染，會對人畜健康造成威脅。因此，對山羊隱孢子蟲病進(jìn)行流行學(xué)調(diào)查和基因型分析，能夠有效防控山羊隱孢子蟲病并保障居民的公共健康。本研究對鄭州市不同縣市山羊隱孢子蟲病流行情況進(jìn)行調(diào)查，并對獲得的隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，確定其基因型和種系發(fā)育關(guān)系，為鄭州市山羊隱孢子蟲病的防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2017年3—11月從鄭州市不同縣市的山羊養(yǎng)殖場采集山羊糞便樣品276份(包括中牟縣84份、新密市93份、滎陽市99份)，其中0～6月齡、6～12月齡和12月齡以上山羊糞便樣品數(shù)量分別為62份、94份和120份。每份糞便樣品50～100 g，分別置于封口袋中，標(biāo)記后于4 ℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

TaqMix和DNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，PCR儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀等購自上海天能科技有限公司，不同規(guī)格移液器購自賽默飛科技有限公司，引物合成和基因序列測定由上海生工生物工程科技公司完成。

1.3 山羊隱孢子蟲的卵囊檢測

取被檢糞便樣品(約30 g)置于盛有100 mL蒸餾水的燒杯中，充分?jǐn)嚢杌靹?，?jīng)孔徑為0.15 mm銅篩過濾，將濾液以3 000 r/min離心5 min，棄掉上清，取適量飽和蔗糖溶液與沉淀充分混勻，并以2 500 r/min離心20 min，用自制鐵環(huán)蘸取液面進(jìn)行制片，于400倍顯微鏡下檢測，并參考文獻(xiàn)[10]對隱孢子蟲形態(tài)進(jìn)行確定。

1.4 山羊隱孢子蟲的分子鑒定

設(shè)計并合成擴(kuò)增隱孢子蟲核糖體18S rRNA基因序列的引物(18S-F、18S-R)，PCR擴(kuò)增隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列，目的基因大小為800 bp左右。PCR體系(50 μL)：2×PCR Mix 25.0 μL，無RNA酶水19.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取6.0 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，將所得陽性樣品送至測序公司進(jìn)行雙向測序。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用ClustalX 1.8軟件對獲得的序列進(jìn)行拼接，同時于GenBank下載隱孢子蟲分離株18S rRNA基因序列，應(yīng)用DNAstar軟件對本研究獲得及下載的序列分析同源性和蟲株的遺傳變異情況。此外，應(yīng)用MEGA 7.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1 000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄭州市山羊隱孢子蟲感染情況分析

如表1所示，鄭州市山羊隱孢子蟲病的感染率為3.26%(9/276)；不同縣市山羊隱孢子蟲病陽性率存在一定差異，其中以中牟縣最低，為1.12%(1/84)，而新密市和滎陽市隱孢子蟲病陽性率稍高，分別為4.30%(4/93)和4.04%(4/99)。其中，散養(yǎng)場隱孢子蟲病陽性率為3.61%(7/194)，規(guī)模化養(yǎng)殖場為2.43%(2/82)。

表1 鄭州市山羊隱孢子蟲感染情況Tab.1 Prevalence of Cryptosporidium infection in goats from different region in Zhengzhou city

2.2 不同月齡山羊隱孢子蟲感染情況分析

如表2所示，不同月齡山羊隱孢子蟲病流行情況存在一定差異，其中12月齡以上山羊隱孢子蟲病陽性率(1.67%)最低；6～12月齡山羊隱孢子蟲病陽性率稍高，為2.13%；6月齡以下山羊感染情況最為嚴(yán)重，其隱孢子蟲病陽性率為8.06%。

表2 不同月齡山羊隱孢子蟲感染情況Tab.2 Prevalence of Cryptosporidium infection in goats of different month of age

2.3 山羊隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列擴(kuò)增分析

對9份山羊隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，如圖1所示，9份樣品均擴(kuò)增出大小約800 bp的片段，無非特異性條帶，且目的片段大小與預(yù)期相符。

M：DL2000 DNA Marker；1：陰性樣品；2—10：9份山羊隱孢子蟲病陽性樣品

2.4 山羊隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因測序與分析

將9份陽性樣品PCR產(chǎn)物委托測序公司進(jìn)行測序后，去掉兩端不準(zhǔn)確的堿基序列。結(jié)果顯示，獲得的9個隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列大小為821～824 bp，主要大小差異體現(xiàn)在堿基缺失或插入，序列中A+T堿基含量為62.9%～63.1%。同源性分析結(jié)果如圖2所示，得到的9個

圖2 山羊隱孢子蟲分離株18S rRNA基因序列同源性對比結(jié)果Fig.2 Sequence homologies of 18S rRNA gene of Cryptosporidium isolated from goats

隱孢子蟲分離株18S rRNA基因序列(XM-1、XM-2、XM-3、XM-4、XY-1、XY-2、XY-3、XY-4、ZM-1)同源性為97.4%～99.9%，與GenBank中收錄的牛隱孢子蟲(Cryptosporidiumbovis)(KT922231.1和KT922232.1)的同源性超過98.8%，與其他隱孢子蟲分離株同源性較低。

2.5 山羊隱孢子蟲分離株18S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA 7.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，獲得的9個隱孢子蟲分離株位于同一分支；與其他隱孢子蟲分離株所屬分支相比，9個隱孢子蟲分離株所屬分支與已知牛隱孢子蟲分離株(KT922231.1和KT922232.1)聚為一個大分支。

圖3 基于18S rRNA基因序列構(gòu)建的山羊隱孢子蟲分離株系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S rRNA gene of Cryptosporidium isolated from goats

3 結(jié)論與討論

隱孢子蟲是重要的人畜共患性寄生蟲之一，開展關(guān)于隱孢子蟲的流行病學(xué)調(diào)查和蟲種鑒定研究對隱孢子蟲病的防控有積極意義，同時有利于保障公共健康衛(wèi)生。因此，本研究對鄭州市不同縣市收集的276份山羊糞便樣品進(jìn)行隱孢子蟲感染情況調(diào)查，結(jié)果顯示，鄭州市山羊隱孢子蟲病的平均感染率為3.26%，被調(diào)查的中牟縣、新密市和滎陽市3個縣市均出現(xiàn)隱孢子蟲病陽性山羊。此外，鄭州市部分縣市山羊隱孢子蟲病流行情況較河南安陽(0.34%)[11]和安徽及周邊縣市(0.90%)[12]嚴(yán)重，但沒有四川省宜賓(9.90%)[13]嚴(yán)重，提示山羊隱孢子蟲病流行情況可能具有地理差異性。此外，大量研究表明，山羊隱孢子蟲感染情況差異與宿主發(fā)育階段有關(guān)，王永立等[14]對河南省綿羊隱孢子蟲流行情況調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他發(fā)育階段羊群相比，3周齡內(nèi)羊群隱孢子蟲病感染情況更為嚴(yán)重。陳靜等[15]對重慶市部分地區(qū)山羊隱孢子蟲病調(diào)查結(jié)果顯示，2～3月齡和產(chǎn)后1月齡羔羊的山羊隱孢子蟲病陽性率比其他發(fā)育階段山羊高。本研究調(diào)查結(jié)果與前者類似，6月齡以下山羊隱孢子蟲病陽性率(8.06%)高于6～12月齡和12月齡以上山羊(2.13%和1.67%)，調(diào)查結(jié)果提示幼齡山羊更易感染隱孢子蟲病，應(yīng)為重點(diǎn)防控對象。

對獲得的9個山羊隱孢子蟲分離株核糖體18S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，本研究獲得的9個隱孢子蟲分離株18S rRNA基因序列大小為821～824 bp，其種內(nèi)核苷酸同源性為97.4%～99.9%，與已知牛隱孢子蟲分離株(KT922231.1和KT922232.1)的同源性最高，高于98.8%，且進(jìn)化分析結(jié)果也顯示,本研究所獲得的山羊隱孢子蟲分離株為牛隱孢子蟲。