孔銀波 鄧穎穎 林麗娟 方艷平 黃莉 許心怡 劉天才

1南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所（廣州510515）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部（廣州510515）

B族鏈球菌（group Bstreptococcus，GBS）屬于條件致病菌，可正常寄居于人體陰道和直腸［1］。由于GBS定植率受種族、年齡、區(qū)域等多種因素的影響，不同地區(qū)報(bào)道的孕婦 GBS帶菌率有差異［2，3］。20世紀(jì)70年代，GBS被證實(shí)為圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌［4］，近年來(lái)的研究［5］表明GBS是我國(guó)新生兒早發(fā)型感染的重要病原菌之一，已引起圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)界的高度重視。為降低圍產(chǎn)期母嬰感染的風(fēng)險(xiǎn)，2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組《孕前和孕期保健指南》將孕晚期35～37周孕婦GBS篩查作為產(chǎn)前檢查的備查項(xiàng)目［6］。目前GBS的篩查策略有培養(yǎng)法、PCR法、抗原檢測(cè)法等［7］。培養(yǎng)法可選用血瓊脂、顯色培養(yǎng)基、Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基，PCR法也有多種商用試劑可供選擇。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于孕晚期B族鏈球菌攜帶篩查方法的研究主要是關(guān)于各檢測(cè)方法的靈敏度、特異性的比較，然而合適的篩查策略需要考慮多種因素，目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏B族鏈球菌篩查策略的多維度研究，因此本研究將從篩查的靈敏度及特異性、檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）、檢測(cè)費(fèi)用等多個(gè)維度評(píng)價(jià)幾種篩查策略的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院2017年5月至2018年4月產(chǎn)科門診孕晚期35～37周孕婦的陰道拭子標(biāo)本共200例。其中60例為2017年5月至2018年2月用本室自建PCR法檢測(cè)GBS-DNA陽(yáng)性并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的凍存標(biāo)本，140例為2018年3月至2018年4月新鮮采集的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器5%羊血瓊脂平皿及GBS顯色培養(yǎng)基購(gòu)于生物梅里埃公司，細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)分別采用生物梅里埃VITEK MS MALDI-TOF和VITEK COMPACT2。PCR試劑①購(gòu)于廣東凱普生物科技公司，試劑②購(gòu)于泰普生物科學(xué)有限公司，PCR檢測(cè)采用美國(guó)ABI 7500核酸擴(kuò)增儀。

1.2.2 檢測(cè)方法血瓊脂培養(yǎng)將新鮮采集的陰道拭子接種在血瓊脂平皿上，置于5%CO2培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取灰白色、表面光滑、有乳光、圓形、多呈β溶血的可疑菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢、用血瓊脂平皿進(jìn)行分純培養(yǎng)。分純后用VITEK MS MALDI-TOF進(jìn)行鑒定，用VITEK COMPACT2進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)將新鮮采集的陰道拭子接種在GBS顯色培養(yǎng)基上，置于5%CO2培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取淡紅至深紅色的可疑菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢、用血瓊脂平皿進(jìn)行分純培養(yǎng)。分純后用VITEK MS MALDI-TOF進(jìn)行鑒定，用VITEK COMPACT2進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。PCR法核酸提取及擴(kuò)增操作分別參照兩種PCR試劑的說(shuō)明書進(jìn)行，兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

TAT統(tǒng)計(jì)：用實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)軟件統(tǒng)計(jì)各篩查方法的TAT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和率表示，計(jì)數(shù)資料的分析用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種篩查方法比較140例新鮮采集的標(biāo)本同時(shí)用兩種培養(yǎng)法及兩種PCR法篩查GBS，血瓊脂培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性10例，顯色培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性11例，PCR法①檢出陽(yáng)性12例，PCR法②檢出陽(yáng)性11例，用卡方檢驗(yàn)對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行兩兩比較，四種篩查方法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有8例標(biāo)本四種篩查方法結(jié)果不一致，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。以測(cè)序和培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)四種篩查方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。四種篩查方法的特異度均為100%。PCR法①的靈敏度高于血瓊脂培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)法，PCR法②的靈敏度與顯色培養(yǎng)法相當(dāng)。

表1 四種篩查方法比較（n=140）Tab.1 The comparison of four methods例

2.2 兩種PCR法檢測(cè)效果比較為進(jìn)一步比較兩種PCR法的檢測(cè)效果，分別用兩種方法檢測(cè)60例凍存的陽(yáng)性標(biāo)本（本室自建PCR法檢出［8］）。結(jié)果見(jiàn)表2，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩種PCR法的檢測(cè)效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩種PCR法檢測(cè)效果比較（n=200）Tab.2 The comparison of two PCR methods例

2.3 培養(yǎng)法及PCR法的TAT、檢測(cè)費(fèi)用比較血瓊脂培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法檢測(cè)步驟和收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)相同。培養(yǎng)法及PCR法的TAT和檢測(cè)費(fèi)用比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 培養(yǎng)法和PCR法的TAT及檢測(cè)費(fèi)用比較Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

表3 培養(yǎng)法和PCR法的TAT及檢測(cè)費(fèi)用比較Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

方法培養(yǎng)法（鑒定）培養(yǎng)法（鑒定+藥敏）PCR法TAT（h）48.1±11.2 71.9±11.7 9.9±6.1檢測(cè)費(fèi)用（元）73.5 147 73.6

2.4 GBS藥敏結(jié)果分析140例新鮮采集的標(biāo)本中有11例GBS培養(yǎng)陽(yáng)性。這11株GBS的藥敏情況為：青霉素耐藥0株，克林霉素耐藥10株，萬(wàn)古霉素耐藥0株。用 WHONET5.6軟件分析本院2008-2017年分離的421株GBS的藥敏情況，未發(fā)現(xiàn)青霉素及萬(wàn)古霉素耐藥菌株，克林霉素耐藥率為35.7%。

3 討論

研究證實(shí)，對(duì)孕晚期35～37周的孕婦進(jìn)行GBS篩查，并對(duì)陽(yáng)性患者采取預(yù)防和治療措施，可降低圍產(chǎn)期GBS感染風(fēng)險(xiǎn)［9］。GBS預(yù)防和治療首選的抗生素為青霉素，對(duì)有青霉素過(guò)敏史的孕婦，可選用大環(huán)內(nèi)酯類藥物或萬(wàn)古霉素進(jìn)行治療［10］。本研究140例新鮮采集的標(biāo)本有11例GBS培養(yǎng)陽(yáng)性，藥敏結(jié)果對(duì)青霉素全部敏感，有10例對(duì)克林霉素耐藥。用WHONET5.6軟件分析本院2008～2017年分離的421株GBS的藥敏結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)青霉素耐藥菌株，克林霉素耐藥率較高。對(duì)有青霉素過(guò)敏史的孕婦，需根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選擇抗生素治療方案，不能僅憑經(jīng)驗(yàn)用藥。

近年來(lái)，有學(xué)者的研究表明PCR法鑒定的檢測(cè)陽(yáng)性率高于培養(yǎng)法鑒定［11-12］。由于本研究的樣本例數(shù)較少，使用的檢測(cè)試劑與已報(bào)道的文獻(xiàn)有所不同，本研究中PCR法鑒定的陽(yáng)性率略高于培養(yǎng)法鑒定，但這種差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各廠家的PCR試劑靈敏度略有差異，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用這些試劑盒前需對(duì)其進(jìn)行性能驗(yàn)證，檢測(cè)性能滿足臨床要求時(shí)方能投入使用。在實(shí)際工作中，血瓊脂培養(yǎng)法對(duì)工作人員的鑒別能力要求更高，由于孕婦生殖道中存在多種細(xì)菌，在血瓊脂培養(yǎng)基上，很多其它細(xì)菌生長(zhǎng)快速，使GBS的生長(zhǎng)受到抑制或菌落被覆蓋而容易導(dǎo)致漏檢。顯色培養(yǎng)基能夠有效抑制雜菌生長(zhǎng)，而GBS生長(zhǎng)不受影響，顯色結(jié)果容易觀察，因此顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法是最簡(jiǎn)單、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件及工作人員技術(shù)要求最低的方法，基層實(shí)驗(yàn)室也能完成。PCR法檢測(cè)快速、靈敏，但PCR檢測(cè)需要專有的PCR實(shí)驗(yàn)室，特有的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通基層醫(yī)院較難開(kāi)展，且無(wú)法獲得GBS菌株，無(wú)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，由于陰道拭子標(biāo)本成份復(fù)雜，可能存在PCR抑制物而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，也可能存在非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法、PCR法檢測(cè)GBS的陽(yáng)性率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)法鑒定和PCR法鑒定GBS的費(fèi)用相等，PCR法鑒定GBS的TAT時(shí)間較培養(yǎng)法短。因此對(duì)于已建有PCR實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院，可優(yōu)先考慮PCR法篩查GBS，其檢測(cè)靈敏度和特異性能滿足臨床要求，且不增加檢測(cè)費(fèi)用，TAT時(shí)間＜10 h，有青霉素過(guò)敏史的孕婦，只能選擇培養(yǎng)法篩查GBS并做藥敏試驗(yàn)，TAT時(shí)間更長(zhǎng)但可獲得準(zhǔn)確的用藥指導(dǎo)。未建有PCR實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院，首選顯色培養(yǎng)法篩查GBS，無(wú)青霉素過(guò)敏史的孕婦只需做培養(yǎng)法鑒定而不需要做藥敏試驗(yàn)，有青霉素過(guò)敏史的孕婦則加做藥敏試驗(yàn)。