李清梅 張琴 秦榜勇 代韻柯 李雪
遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科(貴州遵義563000)
外周神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性疼痛是臨床上常見的疼痛。以往研究均表明背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)對疼痛刺激產(chǎn)生興奮信號,再將信號傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)致疼痛的增敏反應(yīng)[1-2],是痛覺信號傳入的初級神經(jīng)元。硫化氫(H2S)是一種具有神經(jīng)活性物質(zhì)的氣體信號分子,內(nèi)源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶(CBS)廣泛參與慢性內(nèi)臟痛、炎癥以及神經(jīng)病理性疼痛的過程[3-5]。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是多種基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)病理性疼痛中也起著重要的作用[6-7]。但在慢性神經(jīng)損傷過程中CBS如何參與神經(jīng)病理性疼痛及其與NF-κB的關(guān)系,報道較少。筆者擬通過觀察CBS抑制劑AOAA對CCI模型大鼠背根節(jié)CBS、NF-κB蛋白表達(dá)的影響,探討慢性坐骨神經(jīng)損傷CCI模型中背根神經(jīng)節(jié)CBS的作用及其與NF-κB的關(guān)系。
1.1 動物分組成功鞘內(nèi)置管的雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量180~200 g,5~6周齡,本實驗嚴(yán)格按照國家疼痛學(xué)會倫理綱要進(jìn)行操作。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=12):CBS抑制劑AOAA組(CCI+AOAA組)、神經(jīng)病理性痛組(CCI組)及假手術(shù)組(Sham組)。術(shù)后1 d開始連續(xù)給藥連續(xù)14 d(1次/d),同一時間給藥,CCI+AOAA組鞘內(nèi)注射CBS抑制劑AOAA(Sigma公司)10 μg/kg 10 μL+ 生理鹽水10 μL,CCI組鞘內(nèi)注射等量的生理鹽水。
1.2 鞘內(nèi)置管腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉,固定,備皮,消毒,沿L5-6間隙作約2 cm長的切口,充分暴露棘突間隙,將無菌的PE-10導(dǎo)管經(jīng)棘突間隙向頭端置入2 ~ 3 cm,參照文獻(xiàn)[8],腦脊液溢出后封閉導(dǎo)管,固定在頸背后皮下,縫合傷口。
1.3 建立大鼠神經(jīng)病理性痛模型建立大鼠神經(jīng)病理性痛模型參照文獻(xiàn)[9]。麻醉固定后,暴露股骨后右側(cè)坐骨神經(jīng)干,間隔1 mm松扎4處,結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉微顫為宜。
1.4 痛閾的測定于術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、7、10、14 d鞘內(nèi)給藥后30 min時隨機(jī)取6只大鼠測定。熱痛閾(TWL):TF2-光熱測痛儀測定。機(jī)械痛閾:2390系列電子von Frey測定。
1.5 Westernblot法檢測脊髓背根神經(jīng)節(jié)CBS和NF?κBp65的表達(dá)水平 取出術(shù)側(cè)L4~6背根神經(jīng)節(jié)組織,立即放入液氮中冷凍保存,檢測蛋白表達(dá)水平。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 19.0軟件分析,計量資料正態(tài)分布的以()表示,采用單因素方差分析組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 機(jī)械痛、熱痛閾值比較與Sham組比較,CCI組術(shù)后各時點(diǎn)熱痛閾縮短,機(jī)械痛閾降低(P<0.05);與CCI組比較,CCI+AOAA組術(shù)后各時點(diǎn)熱痛閾延長、機(jī)械痛閾升高(P<0.05)(表1、2,圖1、2)。
表1 各組大鼠熱痛閾不同時點(diǎn)的比較(n=6)Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s
表1 各組大鼠熱痛閾不同時點(diǎn)的比較(n=6)Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s
注:與Sham組相比,#P<0.05;與CCI組相比,*P<0.05
組別Sham組CCI組CCI+AOAA組術(shù)前1 d 24.0±2.4 24.1±1.9 24.1±1.9術(shù)后1 d 23.9±2.0 11.4±1.8#15.7±1.3*術(shù)后3 d 24.1±1.7 11.9±1.9#18.0±2.1*術(shù)后7 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.6*術(shù)后10 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.5*術(shù)后14 d 24.2±1.8 11.8±1.8#19.5±1.4*
表2 3組大鼠機(jī)械痛閾不同時點(diǎn)的比較(n=6)Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s
表2 3組大鼠機(jī)械痛閾不同時點(diǎn)的比較(n=6)Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s
注:與Sham組相比,#P<0.05;與CCI組相比,*P<0.05
組別Sham組CCI組CCI+AOAA組術(shù)前1 d 33.7±1.2 33.5±1.4 33.5±2.7術(shù)后1 d 33.9±2.1 19.8±1.4#24.2±2.6*術(shù)后3 d 33.6±2.4 18.3±1.2#23.8±3.2*術(shù)后7 d 33.7±2.3 17.7±2.1#24.6±2.2*術(shù)后10 d 33.3±1.9 18.0±2.0#25.9±1.8*術(shù)后14 d 35.2±1.2 13.9±3.2#26.2±2.1*
2.2 背根神經(jīng)節(jié)CBS和NF?κBp65的表達(dá) 與Sham組比較,CCI組術(shù)后7和14 d時CBS及NF-κB p65表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與CCI組比較,CCI+AOAA組術(shù)后7和14 d時NF-κB p65及CBS表達(dá)均下調(diào)(P< 0.05)(表3、圖3)。
神經(jīng)病理性疼痛臨床表現(xiàn)為異常痛,痛覺過敏和自發(fā)痛等,其發(fā)病機(jī)制不清。CCI模型是一種經(jīng)典的疼痛模型,可產(chǎn)生明顯的機(jī)械異常痛和熱痛敏[10]。本研究中CCI大鼠均表現(xiàn)出明顯的機(jī)械閾值和熱刺激閾值降低,提示CCI大鼠模型制備成功。
圖1 大鼠熱縮足潛伏期閾值不同時間點(diǎn)的變化(n=6)Fig.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time
表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)NF-κB p65和CBS表達(dá)的比較(n=6)Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s
表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)NF-κB p65和CBS表達(dá)的比較(n=6)Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s
注:與Sham組比較,#P<0.05;與CCI組比較,*P<0.05
組別Sham組CCI組CCI+AOAA組CBS術(shù)后7 d 0.457±0.222 0.775±0.051#0.425±0.061*術(shù)后14 d 0.536±0.044 0.703±0.067#0.349±0.084*NF-κBp65術(shù)后7 d 0.517±0.041 0.830±0.046#0.405±0.028*術(shù)后14 d 0.549±0.083 0.745±0.054#0.264±0.056*
圖3 鞘內(nèi)注射AOAA對CCI大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)CBS及NF-κBp65表達(dá)影響Fig.3 Western Blot showed the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in three group
圖2 大鼠機(jī)械縮足閾值不同時間點(diǎn)的變化(n=6)Fig.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group.
H2S是一種無色、具有臭雞蛋氣味的有毒氣體,內(nèi)源性H2S合成酶CBS大多表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)、脊髓、大腦等神經(jīng)組織中[11-12]。研究報道CBS的上調(diào)在慢性疼痛所致的痛覺過敏中起著重要作用[13-15]。本研究結(jié)果表明,CCI組背根神經(jīng)節(jié)CBS的表達(dá)較Sham組上調(diào),鞘內(nèi)注射CBS抑制劑AOAA可減輕大鼠神經(jīng)病理性痛,提示CBS參與了大鼠神經(jīng)病理性痛的形成和維持。
NF-κB是位于細(xì)胞質(zhì)中以p50/p65異二聚體為形式的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,與抑制性蛋白(inhibitor kappa B,IkB)結(jié)合而呈非活性狀態(tài),被激活后,IkB解離,暴露出p50亞基上的易位信號和p65亞基上的DNA結(jié)合位點(diǎn),使異二聚物表現(xiàn)出NF-κB的活性,被認(rèn)為是控制早期基因表達(dá)的基因開關(guān)。本實驗給予鞘內(nèi)注射AOAA后,CCI術(shù)后各時點(diǎn)TWL及MWT升高,術(shù)后7和14 d時NF-κB p65表達(dá)下調(diào),提示大鼠神經(jīng)病理性痛形成與背根神經(jīng)節(jié)CBS的上調(diào),進(jìn)一步促進(jìn)了NF-κB活化。這可能與CCI模型中DRG細(xì)胞中H2S產(chǎn)生增加,進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)來激活NF-κB,增強(qiáng)了的NF-κB活化[16]有關(guān),從而參與神經(jīng)病理性疼痛的形成。
綜上所述,大鼠神經(jīng)病理性痛形成與背根神經(jīng)節(jié)CBS的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)NF-κB活化有關(guān)。特異性阻斷CBS信號通路和以NF-κB為靶點(diǎn)的治療可能為慢性疼痛的治療提供新的思路。