張 迪，厲 圓，沈忱思，2*，肖冬雪，柳建設(shè)，趙 鳳，熊明瑜

（1.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織工業(yè)污染防治工程技術(shù)中心，上海 201620；2.上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；4.嘉興市環(huán)境科學(xué)研究所有限公司，浙江 嘉興314100）

四環(huán)素類(lèi)抗生素（Tetracycline antibiotics，TCs）由于其抗菌譜廣、價(jià)格低廉以及具有顯著的治療價(jià)值已經(jīng)被廣泛使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜禽業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)[1]。四環(huán)素類(lèi)抗生素的頻繁使用造成了其在環(huán)境中呈現(xiàn)出一種“假持久性”的現(xiàn)象，所帶來(lái)的一系列環(huán)境污染和生態(tài)安全問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注[1-3]。然而，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，尤其是四環(huán)素（Tetracycline，TC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）等天然四環(huán)素，在水體中極易發(fā)生異構(gòu)化，生成差向四環(huán)素類(lèi)異構(gòu)體[4-7]。因此，重視四環(huán)素類(lèi)母體污染物的同時(shí)，其異構(gòu)化產(chǎn)物造成的環(huán)境污染和生態(tài)安全問(wèn)題也迫切需要關(guān)注。

據(jù)研究報(bào)道，金霉素異構(gòu)化產(chǎn)物4-差向金霉素（4-epi-chlortetracycline，ECTC）在國(guó)內(nèi)外的地表水中均有檢出[8-10]?；谒幬锘瘜W(xué)理論，在弱酸性條件（pH=2～6）下，四環(huán)素類(lèi)抗生素分子中的不對(duì)稱碳原子C-4可逆地發(fā)生異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素；在弱堿性（pH=8）條件下，四環(huán)素的C環(huán)打開(kāi)，轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯化異構(gòu)體（異四環(huán)素）；在酸性較強(qiáng)（pH＜2）的條件下，四環(huán)素C6位上的叔羥基易脫落而形成脫水四環(huán)素[11-12]。同時(shí)，也有報(bào)道指出差向異構(gòu)體的半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，細(xì)胞毒性相比母體藥物明顯增加[13]。然而，自然水體比藥物化學(xué)的研究環(huán)境復(fù)雜得多，四環(huán)素類(lèi)抗生素及其異構(gòu)體對(duì)水體環(huán)境條件十分敏感，且不同種類(lèi)四環(huán)素的降解性質(zhì)差異較大，但目前此方面的研究鮮有報(bào)道。

藻類(lèi)作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。另外，藻類(lèi)較其他水生生物敏感，被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）推薦為模式生物。藻細(xì)胞會(huì)不斷蓄積抗生素，抗生素產(chǎn)生的毒性效應(yīng)將隨著食物鏈的遞增而影響較高營(yíng)養(yǎng)級(jí)別的生物，甚至對(duì)人類(lèi)健康造成威脅[14]。徐冬梅等[15]研究報(bào)道了土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻的細(xì)胞膜通透性及生長(zhǎng)抑制作用差異，姜思等[16]報(bào)道了四環(huán)素等4種常用抗生素對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)及光化學(xué)活性的抑制作用，以上研究均表明四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)藻類(lèi)具有一定的毒性。然而，這些研究均著眼于藥物母體對(duì)藻類(lèi)的毒性影響，對(duì)其代謝及降解產(chǎn)物的毒性效應(yīng)研究報(bào)道甚少。因此，探索四環(huán)素類(lèi)抗生素降解產(chǎn)物的毒性效應(yīng)，有望更加全面地認(rèn)識(shí)抗生素在水體中降解所帶來(lái)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

因此，本研究選取具有代表性的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）為受試生物，選用四環(huán)素類(lèi)抗生素中穩(wěn)定性較弱的金霉素為目標(biāo)化合物，探索金霉素異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻的毒性效應(yīng)并對(duì)其毒性機(jī)制進(jìn)行探討，為全面認(rèn)識(shí)四環(huán)素類(lèi)抗生素因降解和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：UVPC-2401紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）、GXZ型智能恒溫人工培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）、JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、LDZM-40KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、Waters高效液相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters）、Heraeus MultifugeX1冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

供試斜生柵藻（Scenedesmus obliquus，F(xiàn)ACHB-416）藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，抗生素及其異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自百靈威科技有限公司，純度均>90%，質(zhì)譜級(jí)甲酸和乙腈購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，活性氧自由基（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司，其余化學(xué)試劑均為分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。金霉素（Chlortetracycline，CTC），4-差 向 金 霉 素（4-epi-chlortetracycline，ECTC），異金霉素（Iso-chlortetracycline，ICTC）結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 三種金霉素異構(gòu)體的基本結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of three chlortetracycline isomers

1.2 藻類(lèi)培養(yǎng)

按照OECD推薦方法，斜生柵藻藻種在無(wú)菌條件下于BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照周期設(shè)置為12 h光照及12 h黑暗，光照強(qiáng)度為3000～4000 lx，放置于智能恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)3代，鏡檢細(xì)胞正常后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行毒性試驗(yàn)。

1.3 藻類(lèi)毒性試驗(yàn)

按照OECD推薦方法，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻分別接種到50 mL含有CTC、ECTC和ICTC藥物的培養(yǎng)液中進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，藥物的濃度分別設(shè)置為1×10-5、1×10-6、5×10-7mol·L-1，同時(shí)選用不添加藥物的培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)作為對(duì)照組（CK）。試驗(yàn)藻細(xì)胞初始密度約為8.0×105cells·mL-1，各個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。將藻細(xì)胞于含有不同濃度的抗生素中靜置培養(yǎng)72 h，每隔24 h用無(wú)菌注射器取出1 mL測(cè)定吸光度（培養(yǎng)液pH相同，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)）。本實(shí)驗(yàn)建立了斜生柵藻藻密度與吸光度之間的線性關(guān)系，且相關(guān)指數(shù)R2>0.999，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于680 nm處測(cè)定光密度來(lái)表征斜生柵藻藻細(xì)胞的密度，并根據(jù)以下公式計(jì)算藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：

式中：μ為斜生柵藻生長(zhǎng)抑制率；Nt和N0分別為t（24、48、72 h）時(shí)刻和t0（初始接種）時(shí)的藻細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.4 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）解析藻液中CTC及異構(gòu)體降解產(chǎn)物

藻細(xì)胞培養(yǎng)期間，每隔12 h使用無(wú)菌注射器在無(wú)菌條件下取1 mL藻液，并使用0.22 μm纖維素濾膜過(guò)濾，取濾出清液進(jìn)行CTC及異構(gòu)體降解產(chǎn)物濃度的檢測(cè)。CTC及異構(gòu)體降解產(chǎn)物濃度使用高效液相色譜-質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，ESI）測(cè)定。檢測(cè)條件如下：色譜柱為Waters Atlantis C18（2.1 mm×150 mm）；柱溫為30℃；流動(dòng)相為1%甲酸/乙腈（80/20）；進(jìn)樣量和流速分別為10 μL和0.2 mL·min-1，毛細(xì)管電壓20 V；荷質(zhì)比m/z為479。

1.5 藻細(xì)胞亞細(xì)胞形態(tài)的測(cè)定

取暴露72 h后的藻液10 mL，4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，去上清液，參考鄒寧等[17]的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)切片，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min后，在Hitachi H-7650型透射電鏡中觀察。

1.6 粗酶液提取

將暴露72 h后的藻液無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至已滅菌的50 mL離心管中，放置超聲波細(xì)胞破碎機(jī)下破碎8 min，工作10 s，間隔10 s，功率為200 W。細(xì)胞破碎結(jié)束后4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.7 活性氧自由基（ROS）、細(xì)胞通透性、葉綠素及抗氧化系統(tǒng)測(cè)定

斜生柵藻細(xì)胞通透性的測(cè)定參考Ouyang等[18]的方法，采用熒光指示物乙二酸熒光素（FDA）對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度間接反應(yīng)細(xì)胞膜的通透性，葉綠素a采用反復(fù)凍融法[19]測(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)染色法[20]進(jìn)行測(cè)定，本研究中ROS、SOD、CAT的測(cè)定均嚴(yán)格按照南京建成生物工程有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用mean±SD的形式表示，利用GraphPad prism 7和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及單因素方差分析（ANOVA）中的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)LSD法檢驗(yàn)后差異顯著P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 CTC對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制及異構(gòu)體降解產(chǎn)物分析

圖2為3種濃度CTC脅迫下斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制情況。結(jié)果表明，CTC在所測(cè)濃度范圍內(nèi)對(duì)斜生柵藻具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且隨著濃度升高，對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的抑制率增大。在72 h暴露過(guò)程中，CTC于48 h時(shí)對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制率最大，1×10-5、1×10-6、5×10-7mol·L-1的暴露濃度下抑制率分別達(dá)到22.79%、17.78%、15.08%。已有研究提出，四環(huán)素類(lèi)抗生素可通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞核糖體上30S亞基不可逆結(jié)合，阻止氨酰基轉(zhuǎn)移與DNA結(jié)合而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，從而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)[21-22]。然而，本研究還發(fā)現(xiàn)CTC在水相環(huán)境中很不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)變成其他降解產(chǎn)物。因此，我們認(rèn)為四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)藻類(lèi)的抑制機(jī)制除母體藥物的作用之外，其降解產(chǎn)物或是降解產(chǎn)物與母體藥物的混合物對(duì)藻細(xì)胞所產(chǎn)生的不利影響也不可忽視[23]。

圖2 CTC脅迫下斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制情況Figure 2 The growth inhibition rate of Scenedesmus obliquus under CTC stress

據(jù)已有報(bào)道，CTC對(duì)水體條件十分敏感，易產(chǎn)生ECTC、ICTC、脫水金霉素等一系列降解及代謝產(chǎn)物[24]。Halling-Sorensen 等[25]和 Soeborg等[26]研究認(rèn)為，pH、水體溫度及光照強(qiáng)度對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的水解影響顯著，差向四環(huán)素類(lèi)和異四環(huán)素類(lèi)是主要的降解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物中ICTC的半衰期最長(zhǎng)。同時(shí)，Solliec等[27]指出CTC在加標(biāo)的地表水溶液中孵育一個(gè)月后，已經(jīng)基本被轉(zhuǎn)化成ICTC及4-差向異金霉素（4-epiiso-chlortetracycline，4-EICTC）。基于此，為深入考察不同種類(lèi)降解產(chǎn)物的毒性貢獻(xiàn)，本研究使用HPLCMS對(duì)金霉素在斜生柵藻存在下的異構(gòu)體降解產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定。如圖3所示，CTC在藻液中并不穩(wěn)定，24 h已經(jīng)基本轉(zhuǎn)化為異構(gòu)體產(chǎn)物，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CTC逐漸向ICTC轉(zhuǎn)化，并伴隨著少量4-EICTC的產(chǎn)生，ICTC的濃度在36 h達(dá)到最大，隨后，藻液中的異構(gòu)體抗生素濃度降低，這可能是由于藻細(xì)胞會(huì)優(yōu)先積累抗生素，之后再通過(guò)吸附[28]、吸收[29]、降解或代謝[30]等一系列響應(yīng)，將抗生素轉(zhuǎn)化成其他降解產(chǎn)物進(jìn)行釋放。由圖3可以得出，在斜生柵藻存在下的CTC轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要以ICTC為主。

圖3斜生柵藻藻液中CTC的異構(gòu)化產(chǎn)物分布Figure 3 The distribution of isomerized products of CTC in algae suspension

2.2 ECTC、ICTC對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制

圖4 為斜生柵藻暴露于CTC異構(gòu)體降解產(chǎn)物ECTC與ICTC下，72 h內(nèi)的生長(zhǎng)抑制情況。在所測(cè)濃度范圍ECTC、ICTC的脅迫下，斜生柵藻均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制。在ECTC脅迫下，斜生柵藻在48 h時(shí)生長(zhǎng)抑制情況最為嚴(yán)重，1×10-5、1×10-6、5×10-7mol·L-1的ECTC對(duì)斜生柵藻抑制率分別為18.77%、14.86%、13.01%。而在ICTC脅迫下，斜生柵藻生長(zhǎng)抑制率在72 h內(nèi)隨藥物濃度的降低而升高。結(jié)合圖2分析，母體藥物CTC與異構(gòu)體降解產(chǎn)物ECTC、ICTC結(jié)構(gòu)相似，但它們對(duì)于斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制卻表現(xiàn)出了明顯不同的規(guī)律，取代基空間構(gòu)象的不同可能是造成毒性差異的主要原因[31]。此外，由圖5可知，CTC母體藥物暴露較其異構(gòu)體降解產(chǎn)物具有更高的毒性，暴露濃度為1×10-5mol·L-1的CTC與其余各處理組相比，其對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），而作為主要降解產(chǎn)物之一的ICTC的毒性效力最低。但是，結(jié)合圖3中CTC異構(gòu)體降解產(chǎn)物的分布結(jié)果可見(jiàn)，在暴露24 h時(shí)，CTC在藻液中的存在以ICTC形式為主。因此，推測(cè)CTC母體藥物所產(chǎn)生的較高的毒性可能是由于3種異構(gòu)體降解產(chǎn)物的聯(lián)合作用。

2.3 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻亞細(xì)胞形態(tài)的影響

圖6為1×10-5mol·L-13種藥物處理下斜生柵藻的亞細(xì)胞形態(tài)。由圖可知，對(duì)照組的細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形，有較規(guī)則的細(xì)胞壁，具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，葉綠體幾乎充滿了整個(gè)細(xì)胞，而在CTC、ECTC、ICTC脅迫下，藻細(xì)胞有不同程度的損傷，葉綠體萎縮，發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，葉綠體的萎縮會(huì)影響藻細(xì)胞的光合作用，影響藻類(lèi)正常的生長(zhǎng)代謝[32]。其中，CTC處理下細(xì)胞受損最為嚴(yán)重，與其表現(xiàn)出的生長(zhǎng)抑制情況一致。研究表明，在藻細(xì)胞受到外界脅迫時(shí)，其細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，使得細(xì)胞變性，破裂，發(fā)生質(zhì)壁分離，對(duì)葉綠體具有較大的毒害作用，影響藻類(lèi)的光合作用[32-33]。

圖4 ECTC、ICTC脅迫下斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制情況Figure 4 The growth inhibition rate of Scenedesmus obliquus under ECTC and ICTC stress

圖5 10-5mol·L-1CTC在不同時(shí)間與其余各組的顯著性差異分析Figure 5 Analysis of significant difference between 10-5mol·L-1 CTC with other groups at different time

2.4 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻細(xì)胞通透性的影響

圖6 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫下藻細(xì)胞的亞細(xì)胞形態(tài)Figure 6 Subcellular morphology of algal cells after 72 h stress in CTC and its isomer degradation products

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞的第一道屏障，可以選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，通透性是它們主動(dòng)或被動(dòng)地將物質(zhì)輸入和輸出細(xì)胞的能力的指標(biāo)，細(xì)胞膜通透性的改變會(huì)使得有毒物質(zhì)更容易進(jìn)入藻細(xì)胞，在藻細(xì)胞中不斷地進(jìn)行積累，導(dǎo)致藻細(xì)胞的代謝過(guò)程紊亂，從而對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性[34]。已有研究表明，低濃度的四環(huán)素類(lèi)抗生素可以影響淡水綠藻的細(xì)胞膜通透性[15]，因此，本研究也進(jìn)一步對(duì)CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物脅迫下的斜生柵藻細(xì)胞通透性進(jìn)行了考察。圖7為CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫對(duì)斜生柵藻細(xì)胞膜通透性的影響，與對(duì)照組相比，CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物均使斜生柵藻細(xì)胞膜通透性顯著增大，CTC母體藥物及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物均對(duì)斜生柵藻細(xì)胞膜造成一定程度的損傷，也是影響藻類(lèi)正常生長(zhǎng)的重要因素之一。

2.5 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻ROS及抗氧化系統(tǒng)的影響

圖7 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫下對(duì)斜生柵藻細(xì)胞通透性的影響Figure 7 The effects of CTC and its isomer degradation products on cellular permeability of Scenedesmus obliquus in 72 h

據(jù)已有研究報(bào)道，微藻在外源污染物的脅迫下會(huì)應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS，ROS的過(guò)量產(chǎn)生隨之會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損害微藻的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，從而抑制正常生理生化功能[35]?；诖耍狙芯繉?duì)CTC母體藥物及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物脅迫下的斜生柵藻進(jìn)行了ROS分析。結(jié)果如圖8所示，10-5mol·L-1CTC、ECTC、ICTC處理組的藻細(xì)胞在72 h時(shí)的ROS相比于對(duì)照組分別增加了2.19、2.01、1.49倍，且所有處理組均較對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異。細(xì)胞內(nèi)ROS的不斷產(chǎn)生和積累會(huì)破壞ROS積累與清除之間的平衡，從而激發(fā)抗氧化系統(tǒng)的活性。因此，基于ROS的分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步選取了SOD和CAT兩類(lèi)生物體內(nèi)主要的抗氧化酶進(jìn)行分析。圖9呈現(xiàn)了藻細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD的活性變化趨勢(shì)，證實(shí)了藻細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的變化。在CTC母體藥物的脅迫下，藻細(xì)胞內(nèi)的SOD和CAT的活性均顯著升高，與ROS的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)。這可能是由于CTC脅迫下ROS含量顯著升高，藻細(xì)胞產(chǎn)生了脂質(zhì)過(guò)氧化，促使SOD和CAT的活性顯著增加，清除了藻細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧[36]；而在ECTC及ICTC脅迫下，藻細(xì)胞內(nèi)的SOD與CAT的活性變化與對(duì)照組相比差異性明顯減弱，表明了CTC母體藥物對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)ROS及抗氧系統(tǒng)的影響最為明顯。

圖8 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫下對(duì)斜生柵藻ROS的影響Figure 8 The effects of CTC and its isomer degradation products on ROS of Scenedesmus obliquus in 72 h

圖9 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫下對(duì)斜生柵藻CAT和SOD酶活性的影響Figure 9 The effects of CTC and its isomer degradation products on CAT and SOD of Scenedesmus obliquus in 72 h

2.6 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻葉綠素a濃度的影響

葉綠素a是光合作用的重要參數(shù)，其濃度的變化可以直接影響藻類(lèi)生物量的變化，間接反映出斜生柵藻對(duì)3種藥物的毒性反應(yīng)[37]。圖10為CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h暴露對(duì)斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a濃度的影響。結(jié)果表明，3種異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻葉綠素a濃度的影響具有明顯差異，在10-5mol·L-1濃度CTC和ICTC的脅迫下，葉綠素a的濃度與對(duì)照組相比分別顯著下降了23.31%和15.95%，暴露濃度越小，對(duì)葉綠素a的抑制越?。辉贓CTC的暴露下，斜生柵藻葉綠素a含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)合圖8中藻細(xì)胞內(nèi)ROS的升高及生長(zhǎng)抑制情況，我們推測(cè)是藻細(xì)胞受到外界脅迫，大量ROS的積累破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素合成酶的活性，使葉綠素的濃度降低，影響藻細(xì)胞的光合作用，細(xì)胞的新陳代謝變慢，進(jìn)而影響藻細(xì)胞的生物量[32]。

圖10 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫下對(duì)斜生柵藻葉綠素a的影響Figure 10 The effects of CTC and its isomer degradation products on chlorophyll-a of Scenedesmus obliquus in 72 h

2.7 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對(duì)斜生柵藻可溶性蛋白質(zhì)的影響

據(jù)已有研究報(bào)道，四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)藻類(lèi)的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)在抑制蛋白質(zhì)合成和葉綠體生成方面，從而對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[38]。由圖11可見(jiàn)，在CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物的脅迫下，藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的濃度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且濃度越大，下降趨勢(shì)愈顯著，CTC和ECTC處理下的斜生柵藻的可溶性蛋白質(zhì)的濃度分別下降了31.46%、22.76%、21.99%和24.05%、17.91%、12.57%。而ICTC脅迫對(duì)藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)濃度的影響較小，不同處理下的濃度下降均低于10%，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。由此進(jìn)一步可得CTC、ECTC、ICTC雖然具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但取代基空間構(gòu)象的不同會(huì)導(dǎo)致藥物與藻細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)不同，因而產(chǎn)生不同的毒性效應(yīng)[39]。

圖11 CTC及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物72 h脅迫對(duì)斜生柵藻可溶性蛋白質(zhì)的影響Figure 11 The effects of chlortetracycline and its isomers on soluble protein content of Scenedesmus obliquus in 72 h

3 結(jié)論

（1）CTC對(duì)斜生柵藻具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且在斜生柵藻存在下，CTC轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要以ICTC為主。CTC、ECTC、ICTC雖然結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但對(duì)斜生柵藻有顯著的異構(gòu)體毒性差異，在相同的暴露濃度下，生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)為CTC>ECTC>ICTC。

（2）CTC母體藥物對(duì)藻細(xì)胞的光合作用、蛋白質(zhì)含量、活性氧及抗氧化酶與對(duì)照組相比均具有顯著性差異，金霉素內(nèi)酯化異構(gòu)體（ICTC）對(duì)藻細(xì)胞則具有較低的毒性效應(yīng)。

（3）金霉素抗生素在環(huán)境中不斷地進(jìn)行積累和代謝，在斜生柵藻存在下CTC最主要的中間產(chǎn)物為其內(nèi)酯化產(chǎn)物及其差向異構(gòu)化產(chǎn)物，CTC母體藥物與其異構(gòu)體降解產(chǎn)物雖然具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但取代基空間構(gòu)象的不同會(huì)導(dǎo)致藥物與藻細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)不同，因而對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生不同的毒性效應(yīng)。