周蓉芳 毛建華 壽曉玲 王雁 王伯忠

[摘要]目的探討Robo4敲除對大鼠急性心肌梗死后缺血心肌微血管生成的影響。

方法采用結(jié)扎左冠狀動脈主干方法復(fù)制大鼠急性心肌梗死模型，分為Robo4敲除大鼠假手術(shù)組（Robo4 sham）、SD大鼠假手術(shù)組（SD sham）、Robo4敲除大鼠心肌梗死組（Robo4 MI）和SD大鼠心肌梗死組（SD MI）。14天后提取大鼠MI邊緣區(qū)心肌組織，VWF8免疫組織化學(xué)染色，檢測微血管生成密度（MVD）。結(jié)果兩假手術(shù)組間MI邊緣區(qū)MVD無明顯變化[（2.27±0.53）個比（1.89±0.34）個，P>0.05]。與SD sham組相比，SD MI組MI邊緣區(qū)MVD顯著增加[（16.63±3.13）個比（1.89±0.34）個，P<0.01]。與SD MI組相比，Robo4 MI組MI邊緣區(qū)MVD顯著增加[（22.49±3.05）個比（16.63±3.13）個，P<0.05]。結(jié)論大鼠急性心肌梗死14天后缺血心肌微血管生成增加，且Robo4敲除可以促進(jìn)缺血心肌微血管生成。

[關(guān)鍵詞]Robo4;急性心肌梗死;微血管生成

中圖分類號：R361;R542

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1009-816X（2019）01-0061-03

治療性血管生成，又稱“自身冠狀動脈搭橋”，能減輕心肌缺血壞死，預(yù)防和延緩缺血性心臟病和室壁瘤的形成，改善臨床癥狀和預(yù)后，已逐漸成為急性心肌梗死研究的熱點(diǎn)。神經(jīng)遷移蛋白Slit2和其受體Robo4是近年來發(fā)現(xiàn)的在血管系統(tǒng)中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的信號途徑，一方面能抑制促血管生成因子導(dǎo)致的新生血管簇狀生長;另一方面改善內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而維持完整血管網(wǎng)的屏障功能[1]。目前對于Slit2-Robo4信號途徑的研究主要集中在上調(diào)該信號途徑用于抑制病理性血管生成，而對于下調(diào)該信號途徑在治療性血管生成方面研究不多，尤其是在心肌梗死后缺血心肌中的作用尚不清楚。本研究旨在體內(nèi)動物模型中觀察心肌梗死后大鼠心功能的變化，探討Robo4敲除對大鼠心肌梗死14天后缺血心肌微血管生成的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗動物和試劑：Sprague-Dawley（SD）大鼠委托廣東賽業(yè)有限公司培育Robo4敲除轉(zhuǎn)基因大鼠，并委托浙江省實(shí)驗動物中心進(jìn)行繁殖，取P2代15只，SD大鼠15只，SPF級，雄性，2月齡，體重約200～250g，均由浙江省實(shí)驗動物中心提供。水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Robo4一抗，購自美國abcam;VWF8一抗及免疫組化檢測試劑盒EnVisionTM Two-Step，購自丹麥DAKO;山羊抗兔二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗方法：15只Robo4敲除轉(zhuǎn)基因大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，即：Robo4敲除大鼠假手術(shù)（Robo4 sham）組（5只）和Robo4敲除大鼠心肌梗死（Robo4 MI）組（10只）。15只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，即：SD大鼠假手術(shù)（SD sham）組（5只）和SD大鼠心肌梗死（SD MI）組（10只）。所有大鼠術(shù)前12h禁食不禁水。10%水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉，仰臥位固定，胸部皮膚去毛，碘伏消毒。肢體Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測ECG。口鼻部戴自制呼吸面罩，連接呼吸機(jī)維持呼氣末正壓呼吸（呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：呼吸頻率55～60次/分，呼吸比為1：2，潮氣量為20mL/kg）。以左心耳與肺動脈圓錐之間心大靜脈為標(biāo)志，左心耳下緣2～3mm處進(jìn)針，肺動脈圓錐側(cè)出針，進(jìn)針深度1.5～2mm，寬度2～3mm，結(jié)扎左冠狀動脈主干。肉眼觀察左心室壁變白，ECG QRS波形變高變寬，S波與T波交點(diǎn)（J點(diǎn)）明顯抬高，或者出現(xiàn)R波消失，呈典型QS波形時，提示結(jié)扎成功。關(guān)胸，逐層縫合肌肉與皮膚。關(guān)胸前留置靜脈留置針用于抽出胸腔空氣恢復(fù)負(fù)壓。術(shù)后3天肌注10萬單位青霉素鈉抗感染。假手術(shù)組除結(jié)扎外，其余同手術(shù)組。模型復(fù)制后14d取左心室缺血區(qū)冠狀位分為2部分，一部分4%多聚甲醛固定做免疫組織化學(xué)染色;一部分液氮急凍后轉(zhuǎn)-80℃冰箱保存用于Western blotting檢測。提取心肌梗死邊界處心肌組織總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取20ug蛋白，100攝氏度加熱變性5min。Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（Robo4）孵育4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1h，洗膜，ECL顯色系統(tǒng)感光顯影，定量各蛋白條帶的總灰度值。4%多聚甲醛固定12h后，將心肌組織平均分為3段，石蠟包埋在同一平面上，4μm切片。常規(guī)脫蠟、水化，高溫高壓抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min，VWF8一抗37℃孵育60min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS沖洗3次，氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，每張切片選擇心肌梗死邊界處，200倍顯微鏡下每組選取10個視野，視野大小為351.1726um×468.5357um，計數(shù)VWF8標(biāo)記陽性的微血管數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Robo4敲除轉(zhuǎn)基因大鼠鑒定：復(fù)制急性心肌梗死模型14天后，提取心肌梗死邊界處心肌組織，免疫印跡法檢測Robo4表達(dá)變化（見圖1）。在正常心肌組織中，Robo4處于低表達(dá)狀態(tài)。與SD sham組相比，SD MI組Robo4表達(dá)顯著增高（t=6.89，P=0.01）。與SD MI組相比，Robo4 MI組表達(dá)顯著下調(diào)（t=3.90，P=0.02）。

2.2Robo4敲除促進(jìn)缺血心肌微血管生成：復(fù)制急性心肌梗死模型14天后，取左心室組織VWF8免疫組織化學(xué)染色檢測心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度（MVD）（見圖2）。Robo4 sham組與SD sham組相仿，僅有少量微血管生成[（2.27±0.53）個比（1.89±0.34）個，P>0.05]。但與SD sham組比較，SD MI組心肌梗死邊緣區(qū)可見較多的微血管腔形成[（16.63±3.13）個比（1.89±0.34）個，t=10.49，P<0.01]，說明心肌梗死后大鼠缺血心肌微血管生成活化。與SD MI組比較，Robo4 MI組心肌梗死邊緣區(qū)微血管腔顯著增多[（22.49±3.05）個比（16.63±3.13）個，t=3.00，P=0.02]，說明Robo4敲除能促進(jìn)該病理情況下的微血管生成。