單國順,趙啟苗,李 睿,高 陸,鞠成國,賈天柱*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院,遼寧 大連116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學 杏林學院,遼寧 沈陽110167；3.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 藥學科,天津300457；4.修正藥業(yè)集團股份有限公司,吉林 長春130000)

地黃是玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosc h.)的干燥塊根,具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效。熟地黃為生地黃經(jīng)蒸制所制成的加工品,功效為滋陰補血、益精填髓。2015版《中國藥典》中規(guī)定地黃的質(zhì)量控制指標為環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇和苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷。然而,由于環(huán)烯醚萜苷類成分的熱穩(wěn)定性較差,使其多在地黃蒸制的過程中損失殆盡。因此,2015版《中國藥典》中僅保留毛蕊花糖苷的含量作為熟地黃的質(zhì)量控制指標[1]。毛蕊花糖苷(verbascoside)又名阿克苷、麥角甾苷、洋丁香酚苷,作為一個苯丙素苷化合物,其具有很強的抗炎、抗氧化作用,并可調(diào)節(jié)骨代謝、生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的功能[2-4],這些作用也均與地黃生制品的“滋陰”作用相一致。然而,有研究[5,6]表明,地黃經(jīng)蒸制后毛蕊花糖苷的含量會發(fā)生明顯降低。那么,為了提高熟地黃的質(zhì)量和臨床療效,有必要搞清楚在地黃炮制過程中有哪些因素影響了毛蕊花糖苷的含量,以便進一步提高其在熟地黃中的含量,從而為臨床提供真正“質(zhì)優(yōu)效確”的熟地黃飲片。在本研究中,筆者采用HPLC法分析了熟地黃炮制時間、加工方式等因素對毛蕊花糖苷含量的影響情況,以期為高含量毛蕊花糖苷地黃飲片的炮制提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

日本島津公司LC-20AB液相色譜儀(LC-20AB泵,CTO-20A柱溫箱,SIL-20A自動進樣器,CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器)；LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；X/WT數(shù)顯調(diào)節(jié)儀電熱恒溫水浴鍋(余姚市顯星儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫(yī)療器械一廠)。

1.2 藥材與試藥

地黃鮮品采自河南武陟縣,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根,采挖后洗凈泥砂,60℃干燥,制成生地。輔料黃酒購自紹興舜豐釀酒有限公司,批號：20160507。

毛蕊花糖苷對照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號wkq16062004,經(jīng)HPLC測定純度大于98%)；乙腈為色譜純,水為純凈水,其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備

稱取生地黃飲片及個子各1 000 g,按照每100 kg藥材加40 kg水的比例進行回潤,回潤后的地黃飲片及個子分別留樣100g,并于60℃干燥,得樣品S0和T0。剩余樣品分為兩份,一份于高壓鍋內(nèi)采用高壓蒸制,蒸制4 h,并于60℃干燥,得樣品S1和T1；另一份置蒸鍋內(nèi)常壓蒸制,并分別于4、8、12、24、36 h取樣,切厚片(個子),60℃干燥,即得樣品S2(T2)、S3(T3)、S4(T4)、S5(T5)、S6(T6)。

2.2 毛蕊花糖苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為WelchXtimateC18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫：35℃,流速：1.0 m L·min-1,PDA檢測器,檢測波長：334 nm,流動相：0.1%醋酸水-乙腈(82∶18),進樣體積：20μL。詳細色譜見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對照品適量,精密稱定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1 m L含0.22mg毛蕊花糖苷的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取地黃、熟地黃樣品粉末約2.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇100m L,稱定重量,加熱回流提取0.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液50 m L,濃縮至近干,殘渣加流動相溶解,轉(zhuǎn)移至10 m L容量瓶中,并用水稀釋至刻度線,搖勻,用0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

圖1 HPLC 色譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液1、2、5、10、20、40μL,按照“2.2.1”項下色譜條件測定,以對照品進樣量(μg)為橫坐標X,峰面積為縱坐標Y,繪制標準曲線。結(jié)果線性回歸方程為Y=1494100X+18715(r=0.9999),表明毛蕊花糖苷在0.22～8.8 g·L-1濃度范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取上述對照品溶液,在“2.2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次,每次10μL,記錄各自峰面積,結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.61%,表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取熟地黃供試品溶液,室溫放置,分別于0、2、4、8、12、24h進樣分析,每次20μL,記錄各自峰面積,毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.89%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一熟地黃樣品粉末6份,按“2.2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進行分析,結(jié)果毛蕊花糖苷含量的RSD為0.71%,表明本法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的熟地黃(毛蕊花糖苷含量0.256 mg·g-1)6份,每份約1.0g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,各加入毛蕊花糖苷對照品溶液1 m L,按“2.2.3”項方法制備供試品溶液,在“2.2.1”色譜條件下進樣分析,計算毛蕊花糖苷的回收率,結(jié)果平均回收率為99.41%,RSD為1.48%,說明該方法準確可靠。詳見表1。

2.2.2 對照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對照品適量,精密稱定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1m L含0.22 mg毛蕊花糖苷的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取地黃、熟地黃樣品粉末約2.0g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇100 m L,稱定重量,加熱回流提取0.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液50 m L,濃縮至近干,殘渣加流動相溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,并用水稀釋 至刻度線,搖勻,用0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

表1 毛蕊花糖苷加樣回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)果

分別取生地黃飲片、樣品S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6、地黃個子、T0、T1、T2、T3、T4、T5、T6,按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,每批平行3份,精密吸取各供試品溶液各20μL,注入高效液相色譜儀測定,記錄各峰面積,并以外標法計算毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果見表2。

表2 生地黃、不同工藝熟地黃中毛蕊花糖苷含量測定結(jié)果

4 討論

本文所建立的毛蕊花糖苷含量測定方法是在參考2015版《中國藥典》中熟地黃【含量測定】項下方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合實際情況適當調(diào)整的結(jié)果,最終確定流動相組成及比例為乙腈-0.1%乙酸水溶液(18∶82)。在該條件下,目標成分與干擾成分可達到很好的分離效果[1,7-8]。

筆者對地黃蒸制過程中的相關(guān)因素進行了系統(tǒng)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),地黃經(jīng)炮制后毛蕊花糖苷的含量會發(fā)生明顯降低,但蒸制方式,即加壓和常壓蒸制對毛蕊花糖苷含量的影響沒有明顯差異,反倒是“回潤”這一過程可導致毛蕊花糖苷含量降低；而不同的蒸制原料對毛蕊花糖苷含量的影響也具有一定差異,地黃飲片較個子在蒸制過程中毛蕊花糖苷含量隨時間下降的速率更慢。此外,地黃中毛蕊花糖苷的含量雖然隨著蒸制時間的延長而降低,但實際上在蒸制到8 h之后毛蕊花糖苷含量的下降速率才開始加快,而蒸制8 h與12 h的熟地黃在品相上無明顯差異。因此,從保證熟地黃中毛蕊花糖苷含量的角度來看,熟地黃的炮制方法以飲片直接蒸制8 h為佳。

從理論上講,地黃中的毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類,其所含有的酯鍵可在蒸制過程中發(fā)生可逆的酯化反應[9],即酸性條件下毛蕊花糖苷可水解發(fā)生酯鍵斷裂,生成咖啡酸和羥基絡(luò)醇[10],使毛蕊花糖苷的含量降低,這也是地黃在“回潤”的過程中毛蕊花糖苷含量會發(fā)生下降的原因。同時,這些中間產(chǎn)物又可在加熱的酸性條件下通過酯化反應生成毛蕊花糖苷[11,12],從而彌補毛蕊花糖苷的損失,這也是為何地黃經(jīng)蒸制后隨時間變化,毛蕊花糖苷的含量沒有急劇降低的原因。此外,地黃飲片較地黃個子在蒸制過程中含量降低速率低,懷疑也與地黃飲片與環(huán)境接觸面積大、可逆反應所需條件更充足有關(guān)。

綜上所述,為得到毛蕊花糖苷含量更高的熟地黃飲片炮制工藝,本文從理論和實踐上對地黃蒸制過程中的相關(guān)因素進行了系統(tǒng)研究,并結(jié)合傳統(tǒng)工藝進行綜合考量,認為熟地黃的炮制方法以地黃飲片直接蒸制8 h更合理。