馮 佳， 朱順妮， 許 瑾， 王忠銘， 袁振宏,2*

(1.中國科學(xué)院 廣州能源研究所;中國科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640； 2.生物質(zhì)能源河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 鄭州 450002)

化石能源的大量消耗以及所造成的環(huán)境污染，使得大力推進(jìn)生物質(zhì)能等可再生能源技術(shù)的開發(fā)利用以及多元化、規(guī)模化應(yīng)用成為重要發(fā)展思路[1-2]，其中開發(fā)應(yīng)用生物固碳工程和技術(shù)配合CO2零排放的能源新技術(shù)是重要的發(fā)展方向[3]。微藻以其生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、屬非糧食資源以及CO2零排放等優(yōu)勢成為一種優(yōu)質(zhì)生物燃料的原料[4-5]。目前高產(chǎn)油藻株篩選方法主要有天然篩選、細(xì)胞工程以及宏觀生長因素調(diào)控。Zaslavskaia等[6]通過基因工程技術(shù)將編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因引入一種無法進(jìn)行異養(yǎng)生長的微藻(Phaeodactylumtricomutum)細(xì)胞中，使其能在黑暗中利用外源葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)生長并達(dá)到100 g/L的細(xì)胞密度。美國有研究機(jī)構(gòu)[7-8]培育多種富含油脂的綠藻，其在培養(yǎng)基缺氮條件下含油脂達(dá)40%～66%，是自然條件下油脂含量的3～12倍。但是微藻生長速率與油脂富集之間存在很大的相互抑制，當(dāng)微藻達(dá)到最佳生長速率時(shí)，其細(xì)胞中油脂含量較低；而人為控制生長條件使微藻單位干質(zhì)量的油脂含量增加時(shí)，微藻的生長速率和太陽能轉(zhuǎn)化效率則明顯降低[9]。因而在選用天然條件下高產(chǎn)油藻種的基礎(chǔ)上，結(jié)合宏觀調(diào)控和細(xì)胞工程如何獲取高油脂富集力藻株和開發(fā)高產(chǎn)油工藝是關(guān)鍵所在。Illumina高通量測序克服了以往研究方法的不足，RNA-Seq方法具有更高的檢測通量和精確度，可對任意物種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，是轉(zhuǎn)錄組研究的強(qiáng)大工具[10]，如Boyle等[11]用RNA-Seq方法分析出三?；D(zhuǎn)移酶有助于衣藻Chlamydomonas中TAG的累積。Rismani-Yazdi等[12]運(yùn)用關(guān)鍵酶的編碼基因成功識別出綠藻Dunaliellatertiolecta中參與生物合成的代謝途徑。Cheng等[13]也通過Illumina高通量測序鑒別了菱板藻系統(tǒng)分支以及轉(zhuǎn)錄本功能分類等，從微觀層面分析研究了油脂富集優(yōu)勢突變藻株的代謝機(jī)理。國內(nèi)外關(guān)于綠球藻的研究分析非常少，因此很有必要對綠球藻進(jìn)行微觀層面的剖析。本研究選用天然條件下生長好且含油高的綠球藻GIEC-38作為研究對象，利用Illumina高通量測序RNA-Seq方法對細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測定，分析了轉(zhuǎn)錄本的功能并對代謝通路和基因表達(dá)譜進(jìn)行注釋。同時(shí)通過缺N培養(yǎng)提高細(xì)胞油脂含量并對比細(xì)胞表達(dá)譜分析基因表達(dá)差異，以期探索發(fā)現(xiàn)N脅迫對于細(xì)胞微觀代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 藻株及培養(yǎng)基

綠球藻GIEC-38(Chlorococcumsp.)，中國科學(xué)院廣州能源研究所生物質(zhì)能生化轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室分離純化所得。BG-11培養(yǎng)基：1 500 mg NaNO3、40 mg K2HPO4·3H2O、75 mg MgSO4·7H2O、3 mg 檸檬酸、3 mg 檸檬酸鐵銨、36 mg CaCl2·2H2O、200 mg NaHCO3、1 mg MgNa2EDTA·H2O、1 mL微量元素和999 mL去離子水。微量元素溶液的主要成分為100 mL蒸餾水中含286 mg H3BO3、181 mg MnCl2·4H2O、22 mg ZnSO4·7H2O、8 mg CuSO4·5H2O、39 mg Na2MoO4·2H2O和5 mg Co(NO3)2·6H2O。所有用于測量的藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)均通入1% CO2，放置在恒溫(25±2)℃、光照強(qiáng)度5 000 lx、光暗比24 h∶0 h的柱狀氣升光生物反應(yīng)器中。

1.2 Bligh-Dyer改進(jìn)方法測定細(xì)胞油脂

取適量干藻粉(0.1 g)于10 mL離心管中，加入1 mL氯仿、2 mL甲醇和0.8 mL去離子水，在35 ℃搖床上反應(yīng)30 min后將樣品在7 000 r/min下離心5 min，然后將液相部分移至50 mL離心管中，再次加入1 mL氯仿、2 mL甲醇和0.8 mL去離子水至固相殘?jiān)?，重?fù)上述反應(yīng)步驟直至萃取液澄清無色后收集所有離心后的液體，加入一定體積氯仿和一定體積水，靜置分層，取下層部分利用離心濃縮儀或者烘箱烘至質(zhì)量恒定，即得生物油，計(jì)算藻體的油脂含量，計(jì)算公式為w(油脂)=m(油脂)/m(藻粉)×100%。

1.3 轉(zhuǎn)錄組的測定、拼接和注釋

離心收集對數(shù)期生長的藻細(xì)胞提取總核糖核酸(RNA)[13]，逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)合成互補(bǔ)堿基序列的脫氧核糖核酸(cDNA)并補(bǔ)平，擴(kuò)增后回收進(jìn)而用TBS380定量后在cBot上橋式擴(kuò)增，生成簇，利用Illumina Hiseq4000測序平臺進(jìn)行2×151 bp測序?qū)嶒?yàn)。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，去冗雜后得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。采用Trinity de novo assembler[14]進(jìn)行序列拼接。使用BLAST程序進(jìn)行非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(nr)比對相似度可靠性(E值<10-5)并選取最佳注釋。使用Blast2Go軟件按分子功能、細(xì)胞組分、生物過程對序列基因本體(GO)信息進(jìn)行分類。根據(jù)KEGG基因組、生物通路、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)之間聯(lián)系的集成數(shù)據(jù)庫注釋的基因功能信息對基因參與的代謝通路進(jìn)行分析。

1.4 差異表達(dá)譜測定

表達(dá)統(tǒng)計(jì)軟件RSEM得到基因的表達(dá)量后通過edgeR軟件對統(tǒng)計(jì)出的片段進(jìn)行均一化并計(jì)算表達(dá)差異，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)量變化大于2倍，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于1%。采用goatools 軟件[15]的GO功能對基因和蛋白的功能進(jìn)行限定和描述、KOBAS軟件[16]對代謝通路的顯著性富集進(jìn)行分析，使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算、采用BH方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)以控制計(jì)算的假陽性率，當(dāng)經(jīng)過校正的P值≤0.05時(shí)認(rèn)為此功能顯著富集。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠球藻GIEC-38富集油脂能力

將GIEC-38分別于完全缺氮的BG-11培養(yǎng)基(不含NaNO3)和缺氮的BG-11培養(yǎng)基(NaNO3質(zhì)量濃度0和0.5 g/L)中培養(yǎng)12天，原始藻株的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.67%，在完全缺N的條件下菌種油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅提高，可以達(dá)到50.29%，而在相對缺N的條件下，NaNO3質(zhì)量濃度0.5 g/L時(shí)，藻株不僅生長較快同時(shí)細(xì)胞富集油脂的能力也有大幅提高，其油脂產(chǎn)量每天可以達(dá)到105.50 mg/L，這說明在N缺乏條件下GIEC-38可以大量富集油脂。為了深入探索和解釋GIEC-38油脂產(chǎn)量高的原因，將GIEC-38進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序以及基因表達(dá)譜的測定，從微觀層面探究細(xì)胞內(nèi)部的代謝機(jī)理，同時(shí)對比原始藻株和完全缺N培養(yǎng)下的藻株兩者基因表達(dá)和代謝通路的差異，從分子生物角度出發(fā)對N源的改變對細(xì)胞造成的影響進(jìn)行分析和解釋。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序、拼接和注釋的對比

將GIEC-38進(jìn)行Illumina測序共產(chǎn)生84 234 706條序列數(shù)，經(jīng)過除雜和去冗余后，進(jìn)行拼接共得到74 605條轉(zhuǎn)錄本，長度201～31 026 bp不等，平均長度為841.25 bp；獲得65 984個(gè)基因，平均長度為743.79 bp。為了獲得這些基因的注釋，采用NCBI_NR非冗余蛋白庫為綜合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，查看本物種轉(zhuǎn)錄本序列的同源序列以及其功能信息，采用E值為10-5作為篩選比對結(jié)果的閾值，其中20 952條得到注釋，最相似序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1，由表1可知GIEC-38基因與藻類、細(xì)菌以及動植物相關(guān)等多種物種存在相關(guān)性，這表明GIEC-38可能包含了多種來源的基因[17]，其中與團(tuán)藻Volvoxcarteri相似度最高為16.97%，其次與萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii相似度為15.04%。

表1 GIEC-38轉(zhuǎn)錄本NCBI非冗余蛋白庫BLAST最相似分析

為了進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)錄組基因的功能，利用Blast2GO軟件中GO數(shù)據(jù)庫對于一個(gè)或一組基因按照其參與的生物過程、細(xì)胞成分以及分子功能3個(gè)方面進(jìn)行分類注釋，結(jié)果如表2所示，通過GO注釋可以獲得基因背后所代表的生物學(xué)意義進(jìn)而了解GIEC-38全部基因產(chǎn)物的分類情況。

表2 GIEC-38轉(zhuǎn)錄本GO功能分類統(tǒng)計(jì)

續(xù)表2

功能分類functional classification序列條數(shù)sequence numberGO生物過程biologicalprocess生長growth840040007信號signaling2300023052生物過程的負(fù)調(diào)控negative regulation of biological process1150048519代謝過程metabolic process46860008152生物調(diào)節(jié)biological regulation8700065007免疫系統(tǒng)過程immune system process650002376生殖過程reproductive process1280022414生物過程調(diào)節(jié)regulation of biological process8160050789建立定位establishment of localization8170051234細(xì)胞成分組織或生物合成cellular component organization or biogenesis7940071840節(jié)律過程rhythmic process190048511細(xì)胞死亡cell killing10001906刺激反應(yīng)response to stimulus11860050896生物粘附biological adhesion70022610運(yùn)動locomotion260040011定位localization8430051179

在生物體內(nèi)，基因并不是獨(dú)立存在獨(dú)立作用的，不同基因產(chǎn)物之間是通過有序的相互協(xié)調(diào)來進(jìn)行生物學(xué)功能的，為了獲得GIEC-38細(xì)胞內(nèi)基因的生物功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路的富集分析，共得到344條代謝途徑，分布在細(xì)胞代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和有機(jī)系統(tǒng)這5個(gè)分支，其中包含基因和轉(zhuǎn)錄本數(shù)目最多的前20個(gè)通路如表3所示，核糖體、蛋白質(zhì)、核苷酸、RNA、碳固定、光合作用以及脂代謝等通路都非?；钴S。

表3 GIEC-38細(xì)胞中包含基因和轉(zhuǎn)錄本最多的前20個(gè)代謝通路

2.3 缺氮條件下GIEC-38基因差異表達(dá)

為了確定沒有氮源的培養(yǎng)基對GIEC-38生長的影響，分別提取對數(shù)期原始藻株和完全缺氮培養(yǎng)藻株的RNA進(jìn)行Illumina測序，過濾低質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本后分別獲得91 657 172條和80 363 364條序列，采用對比軟件Bowtie通過與轉(zhuǎn)錄組對比獲得注釋的分別有79 593 640和69 176 164條序列，占比86.84%和86.08%。

通過軟件edgeR對RSEM得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)計(jì)算，以原始藻株作為對照發(fā)現(xiàn)在缺N培養(yǎng)基中培養(yǎng)的藻細(xì)胞內(nèi)有14 817個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、15 282個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其中有868個(gè)基因顯著上調(diào)、1 157個(gè)基因顯著下調(diào)，采用顯著性閾值標(biāo)準(zhǔn)為FDR≤0.05并且log2|FC|≥1。對差異表達(dá)基因按照生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分以及實(shí)現(xiàn)的分子功能進(jìn)行GO注釋，結(jié)果表明GO的注釋遍布41個(gè)分支，可能影響著細(xì)胞碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成中酶的表達(dá)，使得在缺氮的條件下細(xì)胞朝著脂質(zhì)合成的方向進(jìn)行。

對表達(dá)量有差異的基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)71條代謝通路發(fā)生變化，分布在環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)和代謝過程這5個(gè)分支。其中具有顯著性差異的22條代謝通路如表4所示，可以看出，這些代謝通路與碳水化合物、蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的生長密切相關(guān)。

表4 缺N培養(yǎng)條件下GIEC-38細(xì)胞中差異表達(dá)基因KEGG顯著富集前22代謝通路

從變化顯著的代謝通路中分析其基因表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中參與光合作用的多種基因發(fā)生了明顯的變化，而其光合作用碳反應(yīng)中重要的羧化酶核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)表達(dá)量下調(diào)2倍，這直接導(dǎo)致GIEC-38在缺N時(shí)細(xì)胞生物質(zhì)積累有所減少。三羧酸循環(huán)是機(jī)體將糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式，同時(shí)也是糖、脂和蛋白質(zhì)三大類物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐。三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，如草酰乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乙酰CoA等是合成糖、氨基酸、脂肪等的原料。氧化磷酸化位于糖酵解和三羧酸循環(huán)之后，是產(chǎn)生能量來源ATP的主要步驟。這些代謝通路中發(fā)現(xiàn)一些與中間產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達(dá)量增加，這些產(chǎn)生的中間產(chǎn)物為脂肪酸的合成提供了大量原料，有利于細(xì)胞油脂的積累。另外，在和脂類代謝相關(guān)的幾個(gè)通路中基因的表達(dá)也發(fā)生了一些變化。經(jīng)研究表明催化脂肪酸鏈合成的限速酶乙酰輔酶A羧化酶表達(dá)量上升了約3 倍、催化還原反應(yīng)的β-酮脂酰-ACP還原酶和烯脂酰-ACP還原酶I表達(dá)量分別是原來的3.5和1.8倍、催化第一步縮合反應(yīng)的β-酮脂酰-ACP合酶I表達(dá)量上調(diào)了4.4倍、催化酶β-酮脂酰-ACP合酶表達(dá)量上調(diào)2倍以上以及中性脂TAG合成過程中1-?；视?3-磷酸-O-?；D(zhuǎn)移酶等蛋白酶的表達(dá)量是原來的8倍以上，這些基因表達(dá)的變化都推動反應(yīng)朝著油脂合成的方向進(jìn)行，使得GIEC-38在缺N條件下油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅增加。

3 結(jié) 論

通過對綠球藻GIEC-38細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的測定發(fā)現(xiàn)，參與核糖體、蛋白質(zhì)、核苷酸、RNA、碳固定、光合作用以及脂代謝等通路都非常活躍。通過缺N培養(yǎng)GIEC-38油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)50%以上，細(xì)胞中有868個(gè)基因顯著上調(diào)、1 157個(gè)基因顯著下調(diào)，分布在41個(gè)生物學(xué)功能、71條代謝途徑中。其中，與脂類代謝相關(guān)酶表達(dá)量都有明顯上調(diào)，這些促使了細(xì)胞脂類的合成，提高了細(xì)胞的油脂產(chǎn)量。