李崇堯，陳瑩瑩，宋鵬，雷璠，武陽(yáng)，晏彪，馬萍,*

1. 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100 2. 湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，環(huán)境-免疫與神經(jīng)系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)室，咸寧 437100

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)，也被稱為酞酸酯，是一類結(jié)構(gòu)類似的持久性有機(jī)污染物，具有特殊氣味，且不溶于水，難揮發(fā)，凝固點(diǎn)低，易溶于有機(jī)溶劑，其主要作為增塑劑使用，增加塑料制品的柔韌性和拉伸性[1-2]。廣泛的使用使其大量進(jìn)入環(huán)境，已成為全球普遍存在的一種環(huán)境污染物。鄰苯二甲酸酯有多種類型，以鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(benzylbutyl phthalate, BBP)最為常用，研究表明，DEHP、DBP和BBP有生殖發(fā)育毒性[3]。歐盟成員國(guó)已經(jīng)嚴(yán)格限制這3種增塑劑在有關(guān)制品中的含量(歐盟2005/84/EC指令)，頒布指令規(guī)定“DEHP、DBP和BBP含量超過0.1%的玩具及兒童護(hù)理用品，不得在歐盟市場(chǎng)出售”[2]，并且這3種增塑劑也被歐洲化學(xué)品管理局(European Chemical Agency, ECHA)列入高度關(guān)注物質(zhì)(substance of very high concern, SVHC)[4]。與此同時(shí)，一批高分子量、低毒性的新型增塑劑開始得到廣泛的應(yīng)用，鄰苯二甲酸二異癸酯(diisodecyl phthalate, DIDP)就是其中的一種[5-6]。

DIDP可以通過多種途徑進(jìn)入人體[7]，因其暴露途徑較為簡(jiǎn)單，被污染的人群數(shù)目眾多，在人體尿液中已檢測(cè)出DIDP的一些代謝物[8]，故其潛在的健康威脅已經(jīng)受到眾多學(xué)者的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，DIDP雖只具有低毒性，但較高劑量DIDP能使大鼠的存活率和體重下降，肝臟發(fā)生腫脹、重量增加，過氧化物酶體的增生受到促進(jìn)[9]。Thomas等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DIDP和DEHP一樣，可以使過氧化物酶體發(fā)生大量增殖，造成肝臟腫大。

筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DIDP的同系物鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)可引起小鼠肝腎的氧化損傷，而抗氧化劑褪黑素有拮抗作用[11]。DINP也可造成小鼠肺細(xì)胞氧化損傷[12]，維生素E(vitamin E, VitE)在小鼠肺組織氧化損傷中具有拮抗作用[13]。DIDP能否造成機(jī)體的肝組織損傷還有待研究，因而，以雄性BALB/c小鼠為受試動(dòng)物，VitE為拮抗劑，測(cè)定肝組織勻漿中氧化應(yīng)激水平的生物標(biāo)志物，包括活性氧族(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量以及細(xì)胞凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的含量，檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和白蛋白(ALB)水平來評(píng)價(jià)肝功能，同時(shí)觀察肝組織切片的病理變化和熒光染色結(jié)果，探究增塑劑DIDP是否通過氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致雄性小鼠肝臟損傷和細(xì)胞凋亡，以期為全面評(píng)估DIDP的毒性效應(yīng)及分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購(gòu)買6～8周齡雄性BALB/c小鼠70只(合格證號(hào)：No. 42000600025582)，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中。飼養(yǎng)過程中，小鼠養(yǎng)于無菌無病原專用鼠籠內(nèi)，每日定時(shí)定量給予商業(yè)用鼠糧，并及時(shí)補(bǔ)充飲用水。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為50%～70%，保持室內(nèi)安靜，避免強(qiáng)光照對(duì)小鼠的影響。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀(ELx800，美國(guó)Bio-Tek)，多功能熒光酶標(biāo)儀(Hide Chameleon V，芬蘭Hidex)，低溫冷凍離心機(jī)(5424R，德國(guó)Eppendorf)，三用電熱溫水箱(HH-42，北京長(zhǎng)源)，顯微鏡(DP73，日本Olympus)，動(dòng)物自動(dòng)生化分析儀(iMagic-V7，深圳庫(kù)貝爾生物)。

主要試劑：鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)，純度≥99.6%，購(gòu)自Sigma；Hoechst 33258熒光染料，純度>99.9%，購(gòu)自Sigma；生育酚(ocopherol或vitamin E)，純度≥99%，購(gòu)自Sigma；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)，純度>99.9%，購(gòu)自Sigma；蛋白酶K購(gòu)自Sigma；硫代巴比妥酸(TBA)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；Folin-酚試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛；還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購(gòu)自南京建成；8-OHdG ELISA試劑盒購(gòu)自濟(jì)南朋遠(yuǎn)；ALT Assay Kit、AST Assay Kit和ALB Assay Kit均購(gòu)自深圳庫(kù)貝爾。

1.3 動(dòng)物分組與染毒

70只雄性BALB/c小鼠，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表分為7組。包括1個(gè)空白對(duì)照組，4個(gè)DIDP染毒組，1個(gè)VitE對(duì)照組，1個(gè)VitE+DIDP組，每組10只。根據(jù)歐洲食品安全局規(guī)定，成年人每天DIDP的最高攝入量為0.15 mg·kg-1[14]。故設(shè)置0.15、1.5、15和150 mg·kg-1為染毒梯度，以生理鹽水稀釋成0.015、0.15、1.5和15 mg·mL-14種濃度的使用液，以生理鹽水為陰性對(duì)照組；VitE組的劑量為100 mg·kg-1，稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配。對(duì)于VitE+DIDP處理組，給予小鼠150 mg·kg-1DIDP 3 h后，再給藥100 mg·kg-1VitE。每組給藥方式均為灌胃，其劑量為每天10 mL·kg-1，連續(xù)染毒14 d。根據(jù)Ma等[15]的研究，給予DIDP 3 h后，再用維生素拮抗，目的是為了改善和修復(fù)DIDP誘導(dǎo)的氧化損傷。

1.4 血清和肝組織勻漿的制備

染毒結(jié)束后，根據(jù)小鼠體重按比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉，等到小鼠麻醉后，用酒精棉球擦拭，并用手術(shù)剪剪開小鼠胸腔處的皮膚，暴露出心臟所在位置的肌肉，然后用1 mL醫(yī)用注射器斜插入其心臟，緩慢抽取0.8～1 mL左右的血液，注射入離心管(1.5 mL)中，在室溫條件下靜置30 min后，在25 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝置于-80 ℃冰箱。

對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫臼后，取出完整的肝組織，在冷的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.5)中洗凈，用吸水紙吸干水分，然后放至玻璃勻漿器中，加入冷的PBS制成10%的組織勻漿，然后在4 ℃下以10 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝置于-80 ℃冰箱。

1.5 肝組織切片的制備

取完血清后，用頸椎脫臼法處死小鼠，然后立即取出肝組織用PBS沖洗表面的血液，并加入4%的多聚甲醛將其固定，進(jìn)行H&E染色。

1.6 肝組織熒光染色

稱取Hoechst 33258試劑1 mg，用20 mL蒸餾水溶解后，濾過，4 ℃避光保存。使用時(shí)，用10倍的蒸餾水稀釋成染色液，工作濃度為5 mg·L-1。常規(guī)包埋切片后，脫蠟，透明；用PBS或0.9%生理鹽水洗2遍，每次3 min，吸盡液體，手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min；用PBS或0.9%生理鹽水洗2遍，每次3 min；將切片置于載玻片上，滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，然后用Olympus熒光顯微鏡觀察。

1.7 ROS含量的測(cè)定

用PBS將肝組織勻漿稀釋100倍，并將熒光染料DCFA-DA按1∶1 000稀釋。然后再加入100 μL的稀釋勻漿液與100 μL的稀釋熒光染料DCFA-DA于酶標(biāo)板中，輕微搖勻，37 ℃避光5 min，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和528 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.8 GSH含量和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

嚴(yán)格按照GSH試劑盒說明書來測(cè)定其含量，按照Folin-酚法來測(cè)定蛋白含量。其含量計(jì)算方法為：GSH含量(μmol·g prot-1)=[(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本稀釋倍數(shù)÷待測(cè)勻漿蛋白濃度。

1.9 MDA含量測(cè)定

取0.5 mL肝組織勻漿，再加入2 mL 0.6% TBA溶液，放入水浴鍋中沸水浴15 min后，用冷水冷卻后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL于酶標(biāo)板中測(cè)其在450、532和600 nm的吸光值(A450、A532和A600)。MDA含量(cMDA，μmol·mg-1，以prot計(jì))計(jì)算公式為cMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450。

1.10 Caspase-3含量的測(cè)定

嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線按照說明書來繪制，并以此為依據(jù)來確定樣品中Caspase-3的含量。

1.11 肝功能指標(biāo)的測(cè)定

取小鼠血清200 μL于樣杯中，加入雙蒸水600 μL作3倍稀釋，用于ALT、AST和ALB的檢測(cè)來評(píng)價(jià)肝功能。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析法(ANOVA)，然后使用最小顯著性差異法(LSD)檢測(cè)兩組間均數(shù)的差異性，P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠肝組織形態(tài)的光鏡觀察結(jié)果

如圖1所示，對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)正常。0.15 mg·kg-1DIDP組肝細(xì)胞輕度水腫，肝索清晰，肝索肝竇比例尚可。1.5 mg·kg-1DIDP組肝細(xì)胞有中度水腫，肝索可見增寬，索竇受壓。15 mg·kg-1DIDP組肝細(xì)胞有重度水腫，肝索很亂，肝索肝竇比例失常，肝細(xì)胞壞死。150 mg·kg-1DIDP組中央靜脈擴(kuò)張、淤血；肝細(xì)胞水腫，胞漿疏松化，體積增大；肝索結(jié)構(gòu)尚清晰，肝竇變窄。與空白對(duì)照組相比，VitE對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)正常，而150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組肝索增寬，索竇受壓變窄，肝細(xì)胞水腫輕于150 mg·kg-1DIDP組。結(jié)果表明，小鼠肝細(xì)胞的病理?yè)p傷隨著DIDP劑量逐漸增高而不斷加重。給予VitE后，肝細(xì)胞損傷得到減輕。

2.2 小鼠血清ALT與AST含量的變化

ALT與AST均是肝細(xì)胞損傷的敏感性指標(biāo)。如圖2所示，隨著DIDP染毒劑量的升高，血清中ALT與AST含量也逐漸上升。與生理鹽水組相比，高劑量組(150 mg·kg-1)血清ALT含量顯著升高(P<0.05)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清ALT含量顯著減少。與生理鹽水組比較，中高劑量組(15 mg·kg-1)與高劑量組(150 mg·kg-1)血清AST含量顯著升高(P<0.05)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清AST含量顯著減少(P<0.05)。

2.3 小鼠血清ALB含量的變化

ALB反映肝臟慢性損害情況。如圖3所示，隨著DIDP染毒劑量的升高，血清ALB含量逐漸下降。與生理鹽水組比較，高劑量組(150 mg·kg-1DIDP)血清ALB含量顯著減少(P<0.01)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清ALB含量顯著升高(P<0.05)。

圖1 不同處理組小鼠肝切片圖(10×40，H&E染色)注：A. 生理鹽水組；B. 0.15 mg·kg-1 DIDP組；C. 1.5 mg·kg-1 DIDP組；D. 15 mg·kg-1 DIDP組；E. 150 mg·kg-1 DIDP組；F. 100 mg·kg-1 VitE組；G. 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組；DIDP為鄰苯二甲酸二異壬酯，VitE為維生素E。Fig. 1 Liver slices of different groups (10×40, H&E stains)Note: A. Saline group; B. 0.15 mg·kg-1 DIDP group; C. 1.5 mg·kg-1 DIDP group; D. 15 mg·kg-1 DIDP group; E. 150 mg·kg-1 DIDP group; F. 100 mg·kg-1 VitE group; G. 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group; DIDP is didecyl phthalate and VitE is vitamin E.

2.4 小鼠肝組織ROS含量的變化

各組小鼠肝組織的ROS測(cè)定結(jié)果如圖4所示。與生理鹽水組比較，0.15、1.5和15 mg·kg-1DIDP組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，150 mg·kg-1DIDP組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高劑量的DIDP能造成ROS含量的上升。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的ROS含量顯著下降。

2.5 小鼠肝組織GSH含量的變化

各組小鼠肝組織的GSH含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示。與生理鹽水組比較，中低劑量組(0.15、1.5和15 mg·kg-1)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組(150 mg·kg-1)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。高劑量的DIDP可使小鼠肝GSH含量下降。與單獨(dú)DIDP組(150 mg·kg-1)比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組中的GSH含量顯著上升。

圖2 不同處理組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量(n=6)注：* P<0.05，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 2 Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) content in mouse serum of different groups (n=6)Note: * P<0.05, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖4 不同處理組小鼠肝活性氧(ROS)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組相比較；## P<0.01，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 4 Reactive oxygen species (ROS) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; ## P<0.01, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖5 不同處理組小鼠肝還原型谷胱甘肽(GSH)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 5 Glutathione (GSH) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

2.6 小鼠肝組織MDA含量的變化

不同處理組肝組織的MDA含量變化如圖6所示。與生理鹽水組比較，中低劑量組(0.15、1.5和15 mg·kg-1)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組(150 mg·kg-1)的MDA含量顯著升高(P<0.01)。與150 mg·kg-1的DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的MDA含量顯著下降。

2.7 小鼠肝組織Caspase-3含量的變化

各組小鼠肝組織的Caspase-3含量測(cè)定結(jié)果如圖7所示。隨著DIDP染毒劑量的升高，Caspase-3含量逐漸上升。與生理鹽水組比較，高劑量組(150 mg·kg-1)Caspase-3含量顯著升高(P<0.01)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的Caspase-3含量顯著減少。

2.8 小鼠肝組織的熒光染色觀察結(jié)果

通過Hoechst 33258熒光染料對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行熒光染色，染色后的細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及其他組織呈綠色。如圖8所示，生理鹽水組中細(xì)胞核大多數(shù)呈圓形或橢圓形、淡藍(lán)色，視野內(nèi)細(xì)胞核分布密集。但隨著DIDP染毒劑量的上升，細(xì)胞核大多數(shù)不

規(guī)則，開始變形并且縮小，呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核內(nèi)凋亡小體明顯增多。在最高劑量150 mg·kg-1DIDP組中，細(xì)胞核內(nèi)凋亡小體數(shù)目最多。

圖6 不同處理組小鼠肝丙二醛(MDA)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 6 Malondialdehyde (MDA) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖7 不同處理組小鼠肝Caspase-3含量(n=6)注：* P<0.05、** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 7 Caspase-3 content in mouse liver of different groups (n=6)Note: * P<0.05, ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

3 討論(Discussion)

生物體內(nèi)的新陳代謝都會(huì)伴隨著有氧氧化，而肝臟作為人體內(nèi)的重要器官，其代謝功能十分活躍，因而，需要大量的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來維持，并且會(huì)在有氧代謝過程中產(chǎn)生大量的ROS，發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激能夠造成機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的損傷，引起肝組織損傷，進(jìn)而造成肝組織細(xì)胞凋亡和肝組織炎癥的發(fā)生。Ma等[11]的研究表明，氧化應(yīng)激的積累可能是鄰苯二甲酸酯致肝臟損傷和毒理作用的重要分子機(jī)理。ROS是分子氧在還原過程中的一系列中間產(chǎn)物[16]。ROS在機(jī)體正常代謝狀態(tài)下含量很低，受到刺激后大量增多，氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是因?yàn)镽OS的累積，其可使組織出現(xiàn)不同程度的損傷[17]。GSH是ROS的主要清除劑，GSH的消耗可以反映機(jī)體的氧化損傷程度[18]。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組肝組織中的ROS水平顯著增加，并且GSH含量顯著降低，表明高劑量DIDP產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)；同時(shí)，機(jī)體的氧化平衡因?yàn)镚SH的大量減少而遭到破壞。

脂質(zhì)過氧化可以由過量的ROS直接或間接地攻擊脂質(zhì)分子所造成，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性和脆性的改變。膜組分之間的交聯(lián)增加細(xì)胞膜和膜細(xì)胞器的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能障礙，如離子轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝[18]。脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物是MDA，其水平代表脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)弱與快慢。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組的MDA含量顯著增加，表明高劑量DIDP誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化，損傷了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，小鼠的肝組織會(huì)隨著DIDP染毒劑量的不斷升高而出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷。15 mg·kg-1DIDP組肝細(xì)胞有嚴(yán)重水腫，肝索排列無序，肝索肝竇比例失常，肝細(xì)胞壞死。150 mg·kg-1DIDP組中央靜脈擴(kuò)張、淤血；肝細(xì)胞水腫，胞漿疏松化，體積增大；肝索結(jié)構(gòu)尚清晰，肝竇變窄。這表明，較高劑量DIDP可對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)部造成實(shí)質(zhì)性的損傷，從而影響到肝功能。

正常情況下，AST主要存在于組織細(xì)胞中，其中心肌細(xì)胞含量最高，其次為肝臟，但其在血清中含量較低[19]。當(dāng)肝細(xì)胞變性時(shí)，細(xì)胞膜通透性明顯增加，從細(xì)胞內(nèi)分泌出來的主要是ALT，而當(dāng)肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重時(shí)，線粒體內(nèi)的AST便釋放出來。AST含量高可以反映肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，更能反映肝細(xì)胞受損傷的嚴(yán)重程度。極少數(shù)的肝細(xì)胞損傷，就可引起ALT含量的成倍增高。因此，ALT被推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)[20]。本研究中，150 mg·kg-1DIDP組ALT含量顯著上升，15 mg·kg-1和150 mg·kg-1DIDP組AST含量顯著上升，表明中高劑量的DIDP能使小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重受損。

ALB是血清中蛋白質(zhì)的一種，并且其在血清中含量最高，約占總體含量的57%～68%[21]。血清中ALB主要是由肝臟合成[22]，ALB也是反映肝功能的重要指標(biāo)，多種情況均可引起血清中ALB變化[23]。本研究中，150 mg·kg-1DIDP組ALB含量顯著下降，說明高劑量的DIDP能導(dǎo)致小鼠肝功能異常。

圖8 DIDP不同處理組小鼠肝組織熒光染色結(jié)果(10×40)Fig. 8 Fluorescence staining of mouse liver tissue in different treatment groups of DIDP (10×40)

由上述結(jié)果可知，隨著DIDP染毒劑量的增加，肝組織病理?yè)p傷程度逐漸嚴(yán)重，肝細(xì)胞壞死情況也愈加嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致血清中肝功能標(biāo)志物AST在DIDP中、高劑量組水平異常，同時(shí)，ALB水平在DIDP中、高劑量組水平也有異常。本研究中肝功能指標(biāo)印證了肝臟組織切片觀察結(jié)果。

細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵酶是Caspase蛋白酶，而Caspase-3是其家族中最重要的成員之一。大多數(shù)細(xì)胞凋亡均需要通過Caspase-3來實(shí)現(xiàn)介導(dǎo)[24]?？梢哉f，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子。研究表明，氧化損傷可以誘導(dǎo)線粒體開放通透轉(zhuǎn)換孔[25]，而其開放可激活Caspase-3的表達(dá)[26]。研究廣泛證實(shí)，ROS和氧化應(yīng)激可通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)Caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27-28]。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組Caspase-3含量顯著上升，說明高劑量的DIDP能使小鼠肝細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的形成增多。通過Hoechst 33258熒光染色分析結(jié)果表明，當(dāng)DIDP的染毒濃度達(dá)到15 mg·kg-1以上時(shí)，細(xì)胞核開始變形，核由于濃集由淡藍(lán)色逐漸變?yōu)榱了{(lán)色，細(xì)胞核內(nèi)凋亡小體明顯增多，說明較高劑量的DIDP可造成小鼠肝組織細(xì)胞凋亡。

VitE是一種具有代表性的脂溶性天然抗氧化劑。它是維持身體正常新陳代謝的必需元素，因其多種生理功能而被廣泛使用[29]。而VitE能在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用，清除自由基，具有保護(hù)細(xì)胞膜的功能[30-31]。對(duì)150 mg·kg-1DIDP組添加保護(hù)劑VitE后，其肝組織的ROS和Caspase-3含量均顯著下降，GSH含量顯著上升，肝功能損傷與肝組織的病理?yè)p傷減輕，說明VitE可以降低由肝組織氧化應(yīng)激所引起的肝臟損傷和細(xì)胞凋亡，對(duì)其有一定的拮抗作用。

綜上所述，較高劑量的DIDP(≥15 mg·kg-1)誘導(dǎo)下，小鼠肝組織產(chǎn)生過量的ROS，破壞自身的氧化與抗氧化平衡，造成機(jī)體氧化應(yīng)激。而氧化應(yīng)激能夠造成機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的損傷，引起各種病理學(xué)損傷，進(jìn)而造成肝功能損傷與細(xì)胞凋亡。抗氧化劑VitE可通過拮抗氧化應(yīng)激，對(duì)機(jī)體形成保護(hù)作用。本研究結(jié)果證明了DIDP通過氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致雄性小鼠肝臟損傷和細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究DIDP的毒性及分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。