梁杰鋒，馬徐發(fā)，李鈺，鄒沈娟，趙博禮，侯杰

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070

雙酚A(bisphenol A, BPA)，學(xué)名2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷，主要用于生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂及牙科填充物等化工產(chǎn)品，這些產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械、食品罐、嬰兒奶瓶和熱敏紙等商品中[1]。根據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)：2005年中國(guó)BPA年產(chǎn)能為5.8×104t，截至2015年底，中國(guó)BPA年產(chǎn)能達(dá)到115×104t[2]。BPA可通過食品途徑產(chǎn)生毒性效應(yīng)，也可通過滲入生態(tài)系統(tǒng)間接進(jìn)入體內(nèi)[3]。目前BPA在萊州灣和深圳市河流中均被廣泛檢出[4-5]；在日本垃圾滲出液中，BPA檢出濃度高達(dá)17.2 mg·L-1[6]。BPA會(huì)損傷動(dòng)物生殖發(fā)育、遺傳物質(zhì)以及免疫系統(tǒng)[7]，增加人體和水生動(dòng)物的患癌風(fēng)險(xiǎn)[8]。

目前，BPA的毒性效應(yīng)研究主要集中于動(dòng)物，對(duì)水生植物毒性效應(yīng)研究相對(duì)較少。劉紅玲等[9]的研究表明，BPA對(duì)斑馬魚有明顯的毒性作用，96 h-LC50為9.06 mg·L-1，對(duì)魚卵有致畸作用。Mihaich等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(20、50 mg·L-1)BPA導(dǎo)致浮萍(Lemnagibba)葉片密度和生長(zhǎng)量顯著下降，葉面密度和生長(zhǎng)速率7 d-EC50分別為20和32 mg·L-1。Pan等[11]的研究表明，低濃度BPA促進(jìn)擬南芥幼苗鮮重及側(cè)根數(shù)目的增加，高濃度時(shí)顯示抑制作用。水生植物作為水域環(huán)境的重要組成部分，能夠?yàn)槠渌锾峁┦澄锖蜅⒌?，在水生生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，開展BPA對(duì)水生植物的生態(tài)毒性效應(yīng)研究具有重要意義。紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)屬紫萍屬、浮萍科，葉狀體扁平，新個(gè)體之間通過短柄相連，具有繁殖快、易培養(yǎng)、能夠從水中富集吸收重金屬和有機(jī)污染物及生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)，逐漸成為環(huán)境科學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)方面研究的理想模式材料[12-13]。

本研究以紫背浮萍為研究對(duì)象，探究BPA對(duì)其生長(zhǎng)、光合色素含量、氧化損傷情況、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量以及滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化特征，探究紫背浮萍在BPA脅迫下，生長(zhǎng)與光合作用、氧化損傷及抗氧化系統(tǒng)之間的內(nèi)在關(guān)系，為研究BPA對(duì)水生植物的生態(tài)毒性機(jī)制提供理論依據(jù)，旨在為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：紫外可見分光光度計(jì)(UV 2350，尤尼柯(上海)儀器有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 15R，中國(guó)力康)，電子分析天平(BSA224S，德國(guó)賽多利斯公司)，光照培養(yǎng)箱(GZX-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療制造有限公司)，酶標(biāo)儀(INFINITE 200，瑞士帝肯公司)。

試劑：雙酚A(BPA)(≥99%，Sigma-Aldrich公司)，二甲亞砜(DMSO)(分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司)，葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、總抗氧化能力(T-AOC)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽(GSH)、可溶性糖含量和可溶性蛋白試劑盒(購自于南京建成生物工程研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

紫背浮萍采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)池塘，將浮萍浸泡于10%的NaClO和0.1% HgCl22 min除菌，再使用無菌水沖洗后用1/10 Hogland營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)4周[14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則中的浮萍急性毒性測(cè)試法進(jìn)行，BPA試劑配制以DMSO為助溶劑，體積濃度為0.1%，對(duì)照組加入等量助溶劑[15]。取室內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)后葉片完好、大小相近的1 g浮萍隨機(jī)放入裝有滅菌1 L的1/10 Hogland培養(yǎng)液的燒杯中，培養(yǎng)液和燒杯均進(jìn)行過高溫滅菌，分別添加5個(gè)濃度BPA，即0(對(duì)照)、1、5、20和50 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。紫背浮萍放置于(25±1) ℃光照培養(yǎng)箱中，光暗比為16 h L∶8 h D，光照強(qiáng)度為7 000 lux，2 d更換一次培養(yǎng)液[16]，7 d后測(cè)定紫背浮萍相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 紫背浮萍生長(zhǎng)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用吸水紙迅速吸干紫背浮萍表面水分，用電子分析天平稱量其濕重。

1.4.2 光合色素含量及抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定

葉綠素、H2O2、MDA含量，抗超氧陰離子自由基、SOD、POD、CAT、T-AOC、APX和GR活性以及GSH含量的測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.4.3 紫背浮萍滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定

可溶性糖和可溶性蛋白含量測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，在P=0.05的置信水平對(duì)紫背浮萍生理生化指標(biāo)的變化情況進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Graphpad prism 6.01軟件繪圖(在以下各柱形圖中，*表示與對(duì)照組相比，P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 BPA對(duì)紫背浮萍濕重的影響

不同濃度BPA暴露后，與對(duì)照組相比，20 mg·L-1組濕重顯著增加(P<0.05)，50 mg·L-1組濕重顯著降低(P<0.05)，其余2組無明顯變化(圖1)。

2.2 BPA對(duì)紫背浮萍光合色素含量的影響

紫背浮萍光合色素含量變化如圖2所示，1和5 mg·L-1暴露組的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，20 mg·L-1組葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 BPA對(duì)H2O2含量、抗超氧陰離子自由基活性和MDA含量的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，5、20和50 mg·L-1暴露組的H2O2含量顯著降低(P<0.05)，所有BPA處理組的抗超氧陰離子自由基活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，20和50 mg·L-1暴露組MDA含量顯著升高(P<0.05)。

2.4 BPA對(duì)紫背浮萍抗氧化酶活性的影響

紫背浮萍抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)如圖4所示，與對(duì)照組相比，BPA處理組的CAT活性顯著降低(P<0.05)，5、20和50 mg·L-1暴露組POD活性顯著降低(P<0.05)，所有BPA處理組的SOD和GR活性均顯著降低(P<0.05)，20和50 mg·L-1暴露組的總抗氧化能力顯著降低(P<0.05)。

圖1 雙酚A(BPA)對(duì)紫背浮萍濕重的影響注：*P<0.05表示與對(duì)照組相比差異顯著；下同。Fig. 1 The effect of bisphenol A (BPA) on fresh weight of Spirodela polyrrhizaNote: *P<0.05, compared with the control; the same below.

圖2 BPA對(duì)紫背浮萍光合色素含量的影響Fig. 2 The effect of BPA on the photosynthetic pigments contents of S. polyrrhiza

2.5 BPA對(duì)紫背浮萍GSH含量的影響

紫背浮萍GSH含量變化如圖5所示，與對(duì)照組相比，5、20和50 mg·L-1暴露組GSH含量顯著增加(P<0.05)。

2.6 BPA對(duì)紫背浮萍滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

紫背浮萍滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)含量如圖6所示，與對(duì)照組相比，20 mg·L-1組可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)。5、20和50 mg·L-1暴露組組可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 BPA對(duì)紫背浮萍生長(zhǎng)和光合色素含量的影響

植物光合作用、抗氧化系統(tǒng)以及滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中扮演重要角色。綠色植物通過利用太陽能，同化二氧化碳和水制造有機(jī)物并釋放氧氣，促進(jìn)自身生長(zhǎng)。20 mg·L-1組濕重顯著增加，可能是BPA參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮類似細(xì)胞分裂素的作用，誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)[17]。50 mg·L-1組濕重顯著降低，可能是由于高濃度的BPA抑制了細(xì)胞的分裂，抑制紫背浮萍的生長(zhǎng)[18]，這與Xu等[19]和Qiu等[20]的研究結(jié)果基本一致。Xu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度BPA暴露導(dǎo)致玉米幼苗根長(zhǎng)、鮮重和干重增加，但高濃度BPA暴露后，鮮重和干重明顯降低；Qiu等[20]用含有BPA的溶液來培養(yǎng)大豆，發(fā)現(xiàn)低濃度BPA有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，而高濃度的BPA抑制大豆生長(zhǎng)。

圖3 BPA對(duì)丙二醛(MDA)含量、H2O2含量和抗超氧陰離子自由基活性的影響Fig. 3 The effects of BPA on the malondialdehyde (MDA), H2O2 contents and antisuperoxide aninon activity of S. polyrrhiza

Jiao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的BPA通過促進(jìn)葉綠素合成來影響大豆幼苗的光合作用，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，本研究中1 mg·L-1組、5 mg·L-1組和20 mg·L-1組的光合色素含量顯著升高。有研究表明，高濃度的BPA可以降低葉綠素的含量，干擾植物的正常生理活動(dòng)，對(duì)有機(jī)物積累過程產(chǎn)生影響[22-23]。本研究中50 mg·L-1組光合色素含量低于對(duì)照組，表明BPA可能通過影響光合色素含量對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生效應(yīng)[24]。

3.2 BPA對(duì)紫背浮萍抗氧化系統(tǒng)的影響

有研究表明,植物在生長(zhǎng)過程中遇到惡劣環(huán)境，自身產(chǎn)生大量活性氧(ROS)致使氧化還原反應(yīng)失衡，植物體內(nèi)活性氧存在形式主要包括H2O2、·OH以及超氧陰離子(·O2-)，過多的ROS會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)脂、蛋白質(zhì)和DNA等的氧化損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激[25]。隨著BPA濃度增加，H2O2含量和抗超氧陰離子活性降低，BPA暴露組與對(duì)照組之間有顯著差異，說明紫背浮萍在BPA脅迫情況下，體內(nèi)·O2-增加，導(dǎo)致抗超氧陰離子自由基活性降低，H2O2降低可能是體內(nèi)去除活性氧的系統(tǒng)發(fā)揮了作用。MDA是植物體內(nèi)重要的膜脂過氧化產(chǎn)物，Movafeghi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，紫背浮萍在Zn暴露后，MDA含量顯著增加，膜系統(tǒng)受損。本研究中，20 mg·L-1組和50 mg·L-1組MDA含量在暴露組中顯著增加，表明高濃度BPA暴露時(shí)，活性氧誘導(dǎo)氧化損傷，造成膜脂過氧化，對(duì)植物的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生危害[27]。

圖4 BPA對(duì)紫背浮萍抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig. 4 The effects of BPA on the activities of aseorbateperoxidase (APX), catalase (CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR), and total antioxidant capacity (T-AOC) in S. polyrrhiza

圖5 BPA對(duì)紫背浮萍谷胱甘肽(GSH)含量的影響Fig. 5 The effect of BPA on glutathione (GSH) content in S. polyrrhiza

植物體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)維持植物中ROS含量的平衡[28]。SOD能清除·O2-，并催化·O2-形成O2和H2O2的歧化反應(yīng)；CAT主要存在于細(xì)胞過氧化物酶體中，可將H2O2轉(zhuǎn)化為O2和H2O；POD廣泛存在于植物的不同組織中，是反映植物生長(zhǎng)發(fā)育、體內(nèi)代謝狀態(tài)和對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)性的標(biāo)志；APX以H2O2作為氧化劑并催化單脫氫抗壞血酸(MDHA)形成；GR在去除ROS對(duì)植物氧化應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用；T-AOC能夠反映植物體內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總水平。GSH是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，可以減少重金屬對(duì)植物的損傷和羥基自由基的形成[29]。BPA暴露后的CAT、SOD和GR活性均顯著降低，在5、20和50 mg·L-1

圖6 BPA對(duì)紫背浮萍可溶性糖和可溶性蛋白的影響Fig. 6 The effect of BPA on soluble sugar and soluble protein content in S. polyrrhiza

暴露組POD和T-AOC活性均顯著降低，APX活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比沒有顯著差異，GSH含量在5、20和50 mg·L-1組顯著增加，可能是由于BPA暴露后活性氧含量升高，導(dǎo)致抗氧化酶的活性降低，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致：Xu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，紫背浮萍在鐠暴露后，抗氧化酶活性降低，GSH含量增加；Parlak等[31]的研究表明，紫背浮萍隨著納米二氧化鈦含量的升高，CAT與POD活性顯著降低。紫背浮萍可能通過激活各種酶和非酶抗氧化劑來減輕BPA誘導(dǎo)的氧化損傷，抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的變化反映出紫背浮萍抗氧化系統(tǒng)在BPA脅迫后的復(fù)雜變化。

3.3 BPA對(duì)紫背浮萍滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是調(diào)節(jié)植物滲透壓的關(guān)鍵物質(zhì)，有助于植物適應(yīng)外界環(huán)境的脅迫。有研究表明，苧麻葉片的可溶性糖和可溶性蛋白含量在鎘(Cd2+)處理后呈現(xiàn)增加趨勢(shì)進(jìn)而來抵御不良環(huán)境的影響[32]，本研究中，20 mg·L-1組可溶性糖含量顯著升高，5、20和50 mg·L-1暴露組可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照組。紫背浮萍可能通過提高可溶性糖和可溶性蛋白含量，提高滲透調(diào)節(jié)能力，減輕BPA對(duì)于自身的毒性[33]。

綜上所述，低濃度BPA提高紫背浮萍光合色素含量，促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)積累，濕重逐漸增加；BPA濃度升高，植物光合色素含量降低，光合作用降低，有機(jī)物質(zhì)積累較慢，活性氧積累，造成氧化損傷，抗氧化酶體系發(fā)揮作用，膜脂過氧化發(fā)生，植物滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)受到影響，植物生長(zhǎng)受到抑制。