程冰峰，楊倩文，束兆林，繆康，王鳴華,*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095 2. 江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)有限公司，句容 212400

農(nóng)藥在使用后會(huì)直接或間接地進(jìn)入土壤、水體和空氣等介質(zhì)中。而農(nóng)藥進(jìn)入土壤后，不僅對(duì)土壤生物(土壤微生物、蚯蚓等)會(huì)有一定的影響[1]，也可通過(guò)淋溶作用使農(nóng)藥進(jìn)入地下水，造成地下水污染，而且也可以通過(guò)生物富集作用最終進(jìn)入人體，影響人類身體健康[2-3]。農(nóng)藥在土壤中的殘留降解特性，對(duì)農(nóng)藥的合理使用和環(huán)境安全性具有重要指導(dǎo)意義，它除了與農(nóng)藥本身的特性有關(guān)外，也與土壤環(huán)境(如含水量、有機(jī)質(zhì)、黏土含量和pH等)有關(guān)[4]。農(nóng)藥在土壤中的遷移性與農(nóng)藥的水溶性、吸附性和降解性等因素密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)地下水生態(tài)環(huán)境安全性的重要指標(biāo)[5-6]。

異菌脲(iprodione)，又名撲海因，化學(xué)名稱3-(3,5-二氯苯基)-1-異丙基氨基甲酰基乙內(nèi)酰脲，是安萬(wàn)特作物科學(xué)公司(Aventis Co., Ltd.)開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的二甲酰亞胺類高效廣譜、保護(hù)型殺菌劑。適用于防治多種果樹(shù)、蔬菜和瓜果類等作物早期落葉病、灰霉病和早疫病等病害。結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

目前，國(guó)內(nèi)研究主要集中于探究異菌脲在油菜[7]、蘋(píng)果[8]、草莓[9]、黃瓜[10]、番茄[11]等蔬菜和水果中的消解動(dòng)態(tài)和殘留量的測(cè)試方法，也有研究毒死蜱、三唑酮和功夫菊酯3種農(nóng)藥對(duì)異菌脲光化學(xué)降解的影響[12]。國(guó)外也有不少對(duì)異菌脲在作物上殘留量的檢測(cè)[13-14]；Mercadier等[15]和Campos等[16]研究了土壤微生物對(duì)土壤中異菌脲降解的影響以及降解機(jī)理；Wang等[17]研究了異菌脲對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響。關(guān)于異菌脲在土壤中的降解和遷移的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)室內(nèi)模擬方法，研究異菌脲在土壤中的降解及移動(dòng)性，為異菌脲合理使用以及土壤環(huán)境和地下水安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

圖1 異菌脲的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of iprodione

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；色譜乙腈(美國(guó)TEDIA公司)；乙腈(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑公司)；無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉和氯化鈉(均為分析純，廣西西隴化工股份有限公司)。

Agilent 1260高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器，美國(guó)Agilent科技有限公司)；HWS智能恒溫培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；TH-3560全自動(dòng)高壓滅菌鍋(造鑫企業(yè)有限公司)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Buchi公司)；JN25-12D超聲波清洗機(jī)(寧波江南儀器廠)；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭儀器有限公司)；渦旋混合儀(桂寧(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

供試土壤為東北黑土、江西紅壤、南京黃棕壤和青海草甸土，這4種土壤均采自農(nóng)田耕作層土壤，土壤樣品的理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 The physico-chemical properties of the tested soils

1.2 分析條件

色譜柱為Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=60∶40；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。在此條件下，異菌脲保留時(shí)間為5.9 min。

用流動(dòng)相將異菌脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(乙腈為溶劑，濃度1 000 mg·L-1)梯度稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、1.0、5.0和10.0 mg·L-1的異菌脲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述HPLC條件下進(jìn)行測(cè)定，以異菌脲峰面積為縱坐標(biāo)(y)，異菌脲質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為y=161.56x-6.8，R2=0.9999。

1.3 樣品中異菌脲的提取

水樣：取待測(cè)水樣過(guò)0.22 μm濾膜，HPLC測(cè)定樣品中異菌脲含量。

土壤樣品：稱取20 g土壤于100 mL離心管中，加入5 mL水和40 mL乙腈，渦旋5 min，超聲10 min，加入3 g NaCl和4 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋5 min，以4 000 r·min-1離心5 min，取15 mL上清液，過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)濃縮近干，2 mL流動(dòng)相溶解定容，過(guò)0.22 μm濾膜，HPLC測(cè)定樣品中異菌脲的含量。

在空白水樣和土壤樣品中添加異菌脲標(biāo)樣使其添加濃度為0.02、0.2和2.0 mg·kg-1，回收率分別為96.53%～101.29%和88.62%～102.39%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.27%～1.42%和1.81%～4.34%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合檢測(cè)要求。

1.4 異菌脲土壤降解試驗(yàn)

1.4.1 土壤樣品制備

預(yù)培養(yǎng)土壤：分別稱取上述4種土壤于250 mL三角瓶中，加水至土壤飽和持水量的40%，用棉塞將瓶口塞緊，置于人工氣候箱中恒溫(25 ℃)恒濕(75%)預(yù)培養(yǎng)2周。陰干、粉碎和過(guò)篩后備用。

滅菌土壤的制備：將過(guò)20目篩的南京黃棕壤置于121 ℃、1.1 atm高壓滅菌鍋內(nèi)持續(xù)滅菌30 min，將滅菌的土壤樣品置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后再重復(fù)滅菌1次。

去有機(jī)質(zhì)土壤的制備：將過(guò)20目篩的南京黃棕壤置于1 000 mL燒杯中，加入少量去離子水潤(rùn)濕，加入50 mL 體積比為30%的雙氧水溶液，用玻璃棒不斷攪拌以使氧化速率加快。待燒杯和土壤稍冷片刻后，重復(fù)上述過(guò)程，直至土壤中的有機(jī)質(zhì)全部被氧化。將燒杯放于通風(fēng)處?kù)o置，棄掉上層液體，將去有機(jī)質(zhì)土樣晾干、過(guò)篩。

滅菌去有機(jī)質(zhì)土壤的制備：將去有機(jī)質(zhì)土壤按上述方法進(jìn)行滅菌處理。

1.4.2 異菌脲在不同類型土壤中的降解

分別稱取20.0 g預(yù)培養(yǎng)的東北黑土、江西紅壤、青海草甸土和南京黃棕壤樣品若干份，分別置于250 mL錐形瓶中。加入異菌脲-丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使土壤中異菌脲的濃度為2 mg·kg-1，調(diào)節(jié)土壤濕度至飽和持水量的60%，置于(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。定期稱重補(bǔ)充水分。于培養(yǎng)后不同時(shí)間取樣，HPLC檢測(cè)土壤中異菌脲含量。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4.3 土壤含水量和厭氧條件對(duì)異菌脲降解的影響

以南京黃棕壤為供試土壤，調(diào)節(jié)土壤含水量為10%、20%、30%、40%和漬水條件，其他條件與異菌脲不同類型土壤中的降解試驗(yàn)一致。

1.4.4 異菌脲在滅菌和去有機(jī)質(zhì)(滅菌)土壤中的降解

分別稱取滅菌、去除有機(jī)質(zhì)土壤以及滅菌去有機(jī)質(zhì)土壤20.0 g若干份于250 mL三角瓶中，用未處理的南京黃棕壤作為對(duì)照，其他條件與異菌脲在不同類型土壤中的降解試驗(yàn)一致。

1.5 異菌脲在土壤中的移動(dòng)性測(cè)定

分別稱取經(jīng)風(fēng)干、研磨和過(guò)篩(60目)的南京黃棕壤、江西紅壤、東北黑土和青海草甸土樣品10.0 g于燒杯中加水8 mL攪拌，直至成均勻的泥漿狀，用玻璃棒將泥漿均勻涂布于7 cm×20 cm玻璃層析板上，土層厚度約0.7 mm，玻璃層析板在室溫下陰干后，于距玻璃層析板底部1.5 cm處逐滴點(diǎn)上異菌脲-丙酮溶液，點(diǎn)藥量為10.0 μg。待溶劑揮發(fā)后放在以水作為展開(kāi)劑的層析槽內(nèi)，薄板傾斜角度約為30°，板下端淹水0.5 cm，于25 ℃下進(jìn)行薄層層析實(shí)驗(yàn)。當(dāng)展開(kāi)劑到達(dá)距薄板前沿2 cm處時(shí)，取出薄板置于室溫下避光晾干，將土壤薄層等分為6段，分別測(cè)定各段土壤中異菌脲的質(zhì)量濃度。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.6 異菌脲在土壤中淋溶性測(cè)定

分別稱取450 g風(fēng)干、過(guò)篩(20目)的4種供試土壤樣品，加0.01 mol·L-1CaCl2溶液至土壤飽和持水量的60%，裝于內(nèi)徑5 cm，柱長(zhǎng)35 cm的PVC塑料管中，制成30 cm高的土柱，在上端添加1 cm厚的石英砂，將0.5 mg異菌脲的丙酮溶液均勻滴加在石英砂表面，用蠕動(dòng)泵以30 mL·h-1的速度用300 mL 0.01 mol·L-1CaCl2溶液淋洗土柱，淋洗完畢后，將土柱均勻分成3段，分別測(cè)定各段土柱及淋出液中異菌脲的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

土壤降解：農(nóng)藥在土壤中的降解一般用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程描述，土壤降解動(dòng)力學(xué)方程和降解半衰期分別按下式計(jì)算。

ct=c0e-kt

T1/2=ln2/K=0.693/K

式中：c0和ct分別為異菌脲的初始濃度和t時(shí)刻異菌脲的濃度(mg·L-1或mg·kg-1)；K為速率常數(shù)(h-1或d-1)；t為降解時(shí)間(h或d)；T1/2為降解半衰期(h或d)。

土壤遷移：土壤薄層法根據(jù)農(nóng)藥在薄板上的平均移動(dòng)距離(Zp)與溶劑前沿(Zw)的比值求出農(nóng)藥在薄板上的比移值(Rf)。

式中：i為土壤薄板分割數(shù)；Zi為第i段到原點(diǎn)的平均距離(cm)；Mi為第i段農(nóng)藥含量(mg·kg-1)。

土壤淋溶：土柱淋溶法根據(jù)各段土壤及淋出液中的農(nóng)藥含量，分別求出其占添加總量的百分比。

式中：Ri為各段土壤及淋出液中農(nóng)藥含量的百分比；mi為各段土壤及淋出液中農(nóng)藥質(zhì)量(mg)；i=1、2、3、4，分別表示0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm土壤和淋出液；m0為農(nóng)藥添加總量(mg)。

2 結(jié)果與討論(Result and discussion)

2.1 土壤類型對(duì)異菌脲降解的影響

異菌脲在4種土壤中的降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果如表2所示，從表中可以看出，異菌脲在東北黑土、青海草甸土、南京黃棕壤和江西紅壤中的半衰期分別為7.2、8.6、12.7和16.9 d。降解速率常數(shù)分別為0.0958、0.0806、0.0542和0.0411 d-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[18]中農(nóng)藥在土壤中降解性劃分等級(jí)，異菌脲在這4種土壤中均屬于易降解農(nóng)藥。

農(nóng)藥在土壤中的降解途徑一般有微生物降解、水解和光解，避光情況下主要有農(nóng)藥的化學(xué)降解和微生物降解作用[19]。結(jié)合表2的結(jié)果和4種土壤類型的理化性質(zhì)來(lái)看，異菌脲降解以生物降解為主，異菌脲在土壤中的降解可能與有機(jī)質(zhì)含量和pH[20]有關(guān)，異菌脲在東北黑土中的降解速率是江西紅壤中的2.35倍，東北黑土中有機(jī)質(zhì)含量最高(4.62%)，異菌脲降解最快，而江西紅壤中有機(jī)質(zhì)含量最低(1.41%)，異菌脲降解最慢，說(shuō)明有機(jī)質(zhì)對(duì)異菌脲的降解有很大的影響。土壤有機(jī)質(zhì)高，有利于土壤微生物的生長(zhǎng)與繁殖，降解作用增強(qiáng)。青海草甸土與江西紅壤有機(jī)質(zhì)含量相近，但青海草甸土的pH較高，導(dǎo)致異菌脲在青海草甸土中降解速率比江西紅壤中快一倍，說(shuō)明土壤pH對(duì)異菌脲的降解也有一定的影響。土壤pH主要影響微生物的生存環(huán)境及活性，一些微生物在特定的pH值下具有最高的酶動(dòng)力活性，且pH也會(huì)在一定程度上影響農(nóng)藥的水解作用，異菌脲在pH較高時(shí)水解較快。

2.2 土壤含水量和厭氧條件對(duì)異菌脲降解的影響

不同土壤含水量下，異菌脲的降解結(jié)果如圖2所示。當(dāng)土壤含水量為10%、20%、30%、40%和漬水時(shí)，異菌脲的降解速率常數(shù)為0.0385、0.0471、0.0702、0.0963和0.1175 d-1，降解半衰期為18.0、14.7、9.9、7.2和5.9 d。降解速率隨含水量的增加而增大，漬水條件下異菌脲在土壤中的降解速率最快。好氧條件下，異菌脲在土壤中隨著土壤含水量(10%～40%)增加降解速率不斷增大，這可能由于土壤濕度增大，土壤微生物活動(dòng)能力增強(qiáng)，土壤中的酶促反應(yīng)更快，異菌脲降解越快[21]。而當(dāng)異菌脲在漬水條件下時(shí)，異菌脲處在一個(gè)積水厭氧土壤環(huán)境中，其降解速率相比好氧條件更快，說(shuō)明厭氧微生物可能起到主要的作用。

表2 異菌脲土壤降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Soil degradation kinetics parameters of iprodione

圖2 不同土壤含水量下異菌脲在南京黃棕壤中的降解Fig. 2 Degradation of iprodione in Nanjing yellow-brown soil under different moisture

2.3 土壤微生物和有機(jī)質(zhì)對(duì)異菌脲降解的影響

異菌脲在不同處理土壤中的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示。異菌脲在土壤中的降解受微生物和有機(jī)質(zhì)影響較大，通過(guò)對(duì)土壤進(jìn)行滅菌和去有機(jī)質(zhì)處理，與未滅菌土壤中異菌脲的降解情況比較，異菌脲在對(duì)照組中的降解半衰期僅為12.7 d，而在滅菌土壤、去有機(jī)質(zhì)土壤和同時(shí)滅菌并去有機(jī)質(zhì)土壤中的降解半衰期為22.7、46.8和72.2 d，分別是對(duì)照土壤半衰期的1.8倍、3.7倍和5.7倍，即土壤微生物對(duì)異菌脲在土壤中的降解有促進(jìn)作用，而土壤有機(jī)質(zhì)含量對(duì)異菌脲降解影響比微生物的影響更大，這是由于土壤有機(jī)質(zhì)不僅作為土壤微生物生存與繁殖的碳源，影響微生物的生長(zhǎng)與繁殖，而且有機(jī)質(zhì)中的其他成分(動(dòng)植物殘?bào)w及其分泌物)也能加快異菌脲的降解[22]。

2.4 異菌脲在土壤中的移動(dòng)性

異菌脲在不同土壤薄層中和土柱中的分布結(jié)果如圖3和圖4所示。圖3的薄層層析研究結(jié)果表明，異菌脲在南京黃棕壤、江西紅壤、東北黑土和青海草甸土中的Rf值分別為0.19、0.29、0.17和0.17。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，異菌脲在這4種土壤中均屬于不易移動(dòng)。從圖4的土柱淋溶試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在4種土柱中，淋溶速率次序?yàn)榻骷t壤>青海草甸土>南京黃棕壤>東北黑土，異菌脲大部分集中在0～10 cm段，該段農(nóng)藥百分含量均大于50%，即R1>50，根據(jù)各段土柱農(nóng)藥百分含量劃分農(nóng)藥在土壤中的淋溶等級(jí)，說(shuō)明異菌脲在4種土壤中均屬于難淋溶。

農(nóng)藥在土壤中的移動(dòng)性與土壤的理化性質(zhì)和農(nóng)藥本身性質(zhì)有很大關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)，有機(jī)質(zhì)含量越多，對(duì)農(nóng)藥吸附性越大[23]，農(nóng)藥移動(dòng)性越差，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致；而且薄層層析和土柱淋溶都是以土為載體，水為流動(dòng)相，模擬自然條件下農(nóng)藥的移動(dòng)性，農(nóng)藥的水溶性越大，其在土壤的吸附性越差，移動(dòng)性越強(qiáng)，由于異菌脲在水中的溶解度只有0.013 g·L-1(20 ℃)，難溶于水，與水的親和力弱，難隨水相移動(dòng)[24]，從而導(dǎo)致異菌脲在土壤中不易移動(dòng)和難淋溶，因此，異菌脲不會(huì)通過(guò)淋溶作用進(jìn)入地下水導(dǎo)致地下水的污染。

表3 異菌脲在不同處理土壤中降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Degradation kinetic parameters of iprodione in different treatment soil

圖3 異菌脲在土壤薄層層析中的分布Fig. 3 Iprodione distributed in the soils in the thin-layer chromatography test

圖4 異菌脲在不同土柱中的分布Fig. 4 Iprodione distributed in the different soil columns

異菌脲在4種土壤中均屬于易降解農(nóng)藥；土壤濕度越大，異菌脲降解越快，積水厭氧條件下，異菌脲降解最快，說(shuō)明厭氧微生物對(duì)異菌脲降解起到主要作用；土壤微生物和有機(jī)質(zhì)對(duì)異菌脲在土壤中降解起促進(jìn)作用；異菌脲在南京黃棕壤、江西紅壤、東北黑土和青海草甸土中均屬于不易移動(dòng)，且在4種土壤中均屬于難淋溶，淋溶順序?yàn)榻骷t壤>青海草甸土>南京黃棕壤>東北黑土。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，異菌脲在土壤中易降解，不易通過(guò)移動(dòng)和淋溶作用進(jìn)入地下水，造成地下水污染。