曾 秀，張?zhí)m橋，周 姣，王婧祺，戴益民，張錦華*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌330045)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen，Cp)，在自然界廣泛分布，是革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢粗大桿菌。Cp是引起人類食物中毒、多種動物壞死性腸炎、腸毒血癥的重要病原微生物之一[1]。對幼年動物影響較大，被感染的幼畜即使經(jīng)治療存活下來，也會出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象[2]，對動物的生產(chǎn)性能以及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了重大的經(jīng)濟損失。

根據(jù)其主要的4種致死性毒素[2](α、β、ε、ι)，Cp可分為A、B、C、D、E 5種類型，除此之外最新的分類還依據(jù)腸毒素(CPE)和壞死性腸炎毒素B(NetB)增加了F和G型[3]，其中A型和C型Cp是導致動物發(fā)病的主要病原。Cp還產(chǎn)生β2、θ等其它外毒素和侵襲性酶，達16種以上。其中β2毒素是一種具有細胞毒性和致死性的強毒素[4-5]，其由CPB2基因編碼產(chǎn)生，可以由所有型Cp產(chǎn)生[6]，目前CpA的β2毒素研究較多。有研究表明β2毒素可能是α毒素的輔助毒素，β2毒素和α毒素具有協(xié)同作用[7]；也有研究表明β2毒素具有細胞毒性，可以引起豚鼠胃腸道出血壞死[4]；β2毒素在體外試驗中表現(xiàn)出對人Caco-2細胞的毒性作用[6]。但是β2毒素的致病機制還不明確，其對細胞的毒性作用存在較大的爭議，且目前尚未見到與β2毒素相互作用的宿主蛋白的研究報道。因此，本研究首次采用酵母雙雜交技術，以CpA(JXJA17菌株)的β2毒素為“誘餌”蛋白，從豬腸上皮細胞系(IPEC-1)的cDNA文庫中篩選到4個與β2毒素相互作用的宿主蛋白。其中半乳糖凝集素-1(LGALS1)存在于細胞膜外側，具有調(diào)節(jié)細胞生長、細胞黏附、誘導細胞凋亡等作用[7-8]。酵母回交驗證試驗進一步證實β2毒素和LGALS1存在特異相互作用，為進一步探究β2毒素侵入細胞機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 CP JXJA17菌株(CP028149.1)由本實驗室分離鑒定并保存；IPEC-1酵母雙雜交文庫由江西農(nóng)業(yè)大學生命科學與工程學院教研室惠贈；質(zhì) 粒pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53、酵母菌株Y2H Gold均購自Clontech公司；PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；蛋白Marker購自Genview公司；MatchmakerTMGold酵母雙雜交系統(tǒng)購自Clontech公司；帶c-Myc標簽的小鼠單克隆抗體(MAb)、山羊抗小鼠IgG-HRP均購自Sigma公司；化學發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Amersham公司。

1.2 JXJA17菌株β2毒素基因的PCR擴增 根據(jù)Cp β2毒素基因序列(AJ537530.1)，設計擴增該基因(798 bp)的引物(表1)，使用細菌基因組提取試劑盒按照說明書提取JXJA17菌株(CP028149.1)的DNA，以其為模板，以引物BD-β2-F/和BD-β2-R(表1)PCR擴增JXJA17菌株中的β2毒素基因，PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD18-T載體構建重組質(zhì)粒pMD18-β2，重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定后備用。

表1 實驗所用引物Table 1 Primes used in this study

1.3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2的構建與鑒定 質(zhì)粒pMD18-β2經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后膠回收β2毒素基因，連接至質(zhì)粒pGBKT7中構建重組表達質(zhì)粒pGBKT7-β2，轉化Top10感受態(tài)細胞，挑選陽性轉化子擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒pGBKT7-β2經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定后，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序鑒定。

1.4 含β2毒素基因誘餌蛋白的表達與鑒定 使用LiAc法制備酵母菌Y2H Gold感受態(tài)細胞，將測序正確的質(zhì)粒pGBKT7-β2轉化至Y2H Gold中，同時設pGBKT7轉化至Y2H Gold中為陰性對照，菌液涂布SD/-Trp固體平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d～5 d，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序鑒定。

將測序結果正確的pGBKT7-β2/Y2H Gold菌株培養(yǎng)至10 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d，經(jīng)5 000 r/min離心2 min收集細菌；用0.2 mol/L NaOH抽提酵母細胞的總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳、轉膜，用5%脫脂乳室溫封閉1 h，以帶cMyc標簽的小鼠MAb(1∶5 000)為一抗4℃過夜孵育，羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，同時以pGBKT7/Y2H Gold為空白對照，經(jīng)western blot檢測β2毒素基因誘餌蛋白的表達。

1.5 誘餌蛋白β2毒素的毒性及自激活鑒定 將質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T共轉化酵母感受態(tài)細胞作為陽性對照；將質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化酵母感受態(tài)細胞作為陰性對照組；以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2與pGADT7共轉化酵母感受態(tài)細胞作為實驗組，分別取每種轉化重組菌液100 μL各涂布于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板，30℃培養(yǎng)3 d～5 d，觀察結果。

1.6 篩選與β2毒素相互作用的宿主蛋白 將pGBKT7-β2/Y2H Gold重組酵母菌培養(yǎng)至OD600nm=0.8時，離心棄上清，用5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸沉淀，加入1 mL IPEC-1 cDNA文庫混合，同時加入含有卡那霉素(濃度為0.1 mg/mL)的2×YPDA液體培養(yǎng)基45 mL，于30℃低速培養(yǎng)20 h以上，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。當大部分細胞呈現(xiàn)“米老鼠頭”時，離心棄上清，用YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體，離心棄上清，用10 mL 0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸沉淀，并涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d～5 d進行初篩。將初篩獲得的陽性菌落重新涂布至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His再次篩選，將復篩長勢良好的轉化子接種至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d～8 d后提取酵母質(zhì)粒，并將酵母質(zhì)粒轉化至Top10感受態(tài)細胞中提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，對測序結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析。

1.7 質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C的構建 根據(jù)上述篩選并經(jīng)NCBI比對得到的與β2毒素相互作用的LGALS1蛋白基因的全長核苷酸序列設計引物(表1)，以IPEC-1的cDNA文庫為模板，使用引物AD-LGALS1-F/AD-LGALS1-R PCR擴增LGALS1基因的全長；使用引物AD-LGALS1-CF/AD-LGALS1-C-R PCR擴增LGALS1基因的C端序列。反應程序均為98℃10 min；98℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。反應結束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后分別連接至pGADT7載體，構建重組質(zhì)粒pGADT7-LGALS1、pGADT7-LGALS1-C，轉化Top10感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆子經(jīng)PCR鑒定后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序鑒定，鑒定正確的提取質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和質(zhì)粒pGADT7-LGALS1-C備用。

1.8 LGALS1與β2毒素相互作用的回交試驗 將重組質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C分別轉化至1.4得到的pGBKT7-β2/Y2H Gold重組酵母菌中，并以pGADT7-T+pGBKT7-P53轉化該重組菌作為陽性對照，分別以pGADT7-T+pGBKT7-Lam轉化該重組菌以及以pGADT7-T+pGBKT7-β2轉化該重組菌作為陰性對照。分別接種至SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3 d，將培養(yǎng)后的菌液10倍倍比稀釋(100～104)后分別取10 μL各轉化重組菌的SD/-Leu/-Trp菌液依次點在SD/-Leu/-Trp平板上；分別取10 μL上述經(jīng)稀釋的各轉化重組菌的SD/-Leu/-Trp/-His菌液依次點在SD/-Leu/-Trp/-His平板上，于30℃培養(yǎng)3 d～5 d，觀察酵母菌的生長情況。

2 結果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2的鑒定結果 以JXJA17菌株的DNA為模板，PCR擴增結果顯示，擴增得到了約800 bp的目的條帶，與預期大小一致(圖1)。測序結果顯示擴增的β2毒素基因無堿基發(fā)生突變。誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，結果顯示pGBKT7-β2經(jīng)雙酶切后在798 dp處有目的條帶(圖2)，測序結果顯示β2毒素基因無堿基突變。

圖1 β2毒素的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of β2 toxin

2.2 β2毒素蛋白的表達鑒定 將質(zhì)粒pGBKT7-β2轉化至酵母菌株Y2H Gold內(nèi)，涂布SD/-Trp固體平板培養(yǎng)基后，挑取轉化子提取質(zhì)粒并測序鑒定，結果顯示pGBKT7-β2/Y2H Gold中含有質(zhì)粒pGBKT7-β2，且β2基因未發(fā)生堿基突變，表明pGBKT7-β2/Y2H Gold可用于后續(xù)的試驗。采用western blot檢測β2毒素基因的表達情況。結果顯示，pGBKT7-β2/Y2H Gold重組菌可見約48 ku的目的蛋白條帶，而pGBKT7/Y2H Gold未見該蛋白條帶(圖3)，表明β2毒素在酵母菌中能正確表達，滿足后續(xù)試驗的需要。

圖2 質(zhì)粒pGBKT7-β2雙酶切鑒定結果Fig.2 Identification of pGBKT7-β2 plasmid by double digestion

圖3 β2毒素誘餌蛋白表達的檢測結果Fig.3 Detection of the expression of bait protein β2

2.3 誘餌蛋白β2毒素的毒性和自激活鑒定結果分別將質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T共轉化酵母感受態(tài)細胞作為陽性對照；將質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化酵母感受態(tài)細胞作為陰性對照；以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2與pGADT7共轉化酵母感受態(tài)細胞作為試驗組，并分別將各重組菌接種在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上(圖4C)，培養(yǎng)后觀察可見3種菌均能夠在SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長，且菌落大小和數(shù)量基本一致(圖4A)，表明誘餌蛋白β2毒素的表達對酵母菌無毒性。在SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上僅陽性對照能生長(圖4B)，表明誘餌蛋白β2無自激活活性。

2.4 與β2毒素互作蛋白的篩選及序列分析 將pGBKT7-β2/Y2H Gold和IPEC-1 cDNA文庫融合得到的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選長出的菌落接種至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，共獲得了18個陽性克隆菌株。將得到的18個陽性克隆菌株分別提取質(zhì)粒，轉化Top10感受態(tài)細胞并提取質(zhì)粒測序，測序結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，得到4種能與β2毒素蛋白相互作用的IPEC基因，這4種基因序列分別編碼蛋白S20、LGALS1、L12和Atrophin-1(表2)。

圖4 誘餌蛋白β2的毒性(A)和自激活(B)檢測結果Fig.4 β2 bait protein toxicity(A)and self-activating activity assay(B)

表2 與β2毒素蛋白相互作用的細胞蛋白基因測序分析結果Table 2 Sequencing results of genes encoding proteins interacting with β2 toxin

2.5 質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C的構建 以IPEC-1的cDNA文庫為模板，采用不同的引物分別擴增LGALS1基因的全長及其C端序列。結果顯示，分別擴增得到了約400 bp和250 bp的目的條帶，與預期大小一致(圖5)。分別將其與質(zhì)粒pGADT7連接轉化后測序，結果顯示擴增產(chǎn)物分別與LGALS1基因的全長及其C端序列完全一致，表明質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C構建正確。

圖5 LGALS1基因的PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification of LGALS1 gene

2.6 β2毒素與LGALS1全長及其C端相互作用的回交試驗結果 將pGBKT7-53和pGADT7-T共轉化酵母菌作為陽性對照，其在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板上均能生長，并且隨著菌液濃度的降低，其生長的數(shù)量減少；而pGADT7-T和pGBKT7-Lam共轉化酵母菌與pGADT7-T和pGBKT7-β2共轉化酵母菌作為陰性對照，其在SD/-Leu/-Trp平板上能生長，且隨著重組菌的濃度降低，其在SD/-Leu/-Trp平板上生長的數(shù)量減少；同時這兩組陰性對照在SD/-Leu/-Trp/-His平板上幾乎不生長。pGADT7-LGALS1和pGBKT7-β2共轉化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能夠正常生長，但隨著重組菌的菌液濃度不斷降低，其生長的數(shù)量越來越少；該轉化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能夠生長，但隨著菌液濃度的降低，其生長數(shù)量減少，且在菌液稀釋10倍之后就不再生長。表明β2毒素和LGALS1蛋白存在相互作用，但作用強度較弱。pGADT7-LGALS1-C和pGBKT7-β2共轉化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能夠正常生長，但隨著重組菌的菌液濃度不斷降低，其生長的數(shù)量越來越少。該轉化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能夠生長，隨著菌液濃度的降低，其在SD/-Leu/-Trp/-His平板上生長的數(shù)量減少，在菌液稀釋103倍后就不再生長，表明β2毒素與LGALS1蛋白C端能夠發(fā)生較強的相互作用(圖6)。上述結果表明β2毒素與LGALS1蛋白在酵母細胞中存在相互作用，但β2毒素與LGALS1蛋白C端的作用比其與LGALS1完整蛋白的作用更強。

圖6 β2毒素與LGALS1相互作用的回交試驗結果Fig.6 Validation test of the interaction of β2 toxin with LGALS1

3 討論

酵母雙雜交技術是鑒定蛋白質(zhì)互作最有效和最廣泛的分子生物學技術[9]，其具有操作簡單、成本低、高效、敏感度高、應用范圍廣等優(yōu)點。目前，酵母雙雜交技術也被用來探究與已知蛋白(Pik-h蛋白、剛地弓形蟲14-3-3蛋白等)相互作用的蛋白[9-10]。然而，目前未見有將酵母雙雜交技術應用到篩選與Cp β2毒素相互作用的蛋白中，本研究首次將酵母雙雜交技術應用到篩選與Cp β2毒素互作的宿主蛋白。Cp是一種存在于腸道內(nèi)的條件性致病菌，會造成仔豬的腹瀉、壞死性腸炎以及猝死等癥狀[3]，該菌產(chǎn)生的β2毒素對小腸粘膜上皮細胞的作用機制還不明確[5]，本研究構建了Cp β2毒素的重組表達質(zhì)粒pGBKT7-β2，將其轉化至Y2H Gold后能正常表達β2毒素蛋白，且無自激活和自毒性作用。將其作為“誘餌”蛋白，通過酵母雙雜交技術從IPEC-1的cDNA文庫中篩選出與β2毒素相互作用的4種蛋白：S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。S20、L12和Atrophin-1屬于核蛋白，調(diào)控其它蛋白的合成[11-13]，而LGALS1蛋白與細胞的粘附、增殖和凋亡有關[7]，具有進一步的研究價值。LGALS1回交試驗證實了LGALS1蛋白與β2毒素具有特異性的相互作用，但兩者之間相互作用強度較弱。有研究表明LGALS1是一種位于細胞膜中的蛋白，推測β2毒素與其的作用強度可能與其結構有關，因此選擇LGALS1蛋白C端與β2毒素進行相互作用的驗證。結果顯示β2毒素與LGALS1蛋白C端的作用強于其與LGALS1完整蛋白的作用。本實驗所用的C端是從LGALS1蛋白C末端開始的66個氨基酸，其結構中含有6個片層和一個環(huán)狀結構，包含糖結合識別域(CRD)的大部分結構，與完整蛋白相比該區(qū)域可能增加了β2毒素與其作用位點結合的概率，且重組表達的蛋白結構與原蛋白結構可能略有些差異，其具體的作用位點還需要進一步驗證。

LGALS1蛋白(半乳糖凝集素1)又稱為Galectin-1，由LGALS1基因編碼，是哺乳動物凝集素的一種，是最先被報道的一種內(nèi)源糖結合蛋白，參與多種病理、免疫過程，具有促進腫瘤的轉化、參與細胞粘附、調(diào)節(jié)細胞生長、促進細胞凋亡、炎癥反應發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]，并且LGALS1蛋白還是NDV(新城疫病毒)HN蛋白以及VSV(水泡性口炎病毒)G蛋白的受體[14-16]，在這些病毒感染的過程中LGALS1的含量會上升，但是還未有研究表明其為細菌毒素的受體。本次研究也為研究LGALS1蛋白的功能作用提供了新的方向。

本研究采用酵母雙雜交技術篩選并鑒定出與Cp β2毒素相互作用的蛋白質(zhì)LGALS1，該蛋白主要通過C端與β2毒素結合，從而調(diào)節(jié)細胞的炎性因子和細胞凋亡。本研究首次將酵母雙雜交技術應用到篩選與β2毒素互作的宿主蛋白中，為β2毒素的研究提供了新方法，并為進一步研究其細胞毒性和致病機理奠定了基礎。