周 群，周可磊，胡承哲，李 玉，任玉鵬,2，岳 華,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川成都610041)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV基因組大小約15 kb，至少包含10個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，ORF1a和ORF1b基因編碼14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein，NSP)包括NSP1α、NSP1β、NSP2～NSP6、NSP7α、NSP7β、NSP8~ORF12，參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[2]；ORF2～ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，依次編碼囊膜蛋白GP2～GP5、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[3]。其中，NSP2和GP5被認(rèn)為是最易變異的兩個(gè)蛋白。同時(shí)，GP5蛋白也是PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[4]。根據(jù)基因組序列及抗原特性的差異，PRRSV被分為兩大基因型，即以LV株為代表的歐洲型(基因1型)和以VR2332株為代表的北美洲型(基因2型)[5]。

2013年，我國(guó)出現(xiàn)了在NSP2蛋白區(qū)域存在不連續(xù)的131個(gè)氨基酸缺失的類(lèi)NADC30病毒株[1]。目前類(lèi)NADC30病毒株已在我國(guó)大部分省份流行[6]。研究表明，2016年～2017年我國(guó)西南地區(qū)PRRSV類(lèi)NADC30病毒株的流行呈上升趨勢(shì)[1,7]，但具體的流行情況和分子特征仍不明確。本研究主要通過(guò)采集2018年中國(guó)西南地區(qū)疑似PRRS患病保育豬的肺臟或血清等臨床樣本，利用RT-PCR方法對(duì)檢測(cè)到的PRRSV進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)中國(guó)西南地區(qū)類(lèi)NADC30病毒株的基因組特征和遺傳進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行研究，為更好地防控PRRS提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與主要試劑 2018年采集自我國(guó)西南地區(qū)包括四川(23/41)、重慶(6/41)、貴州(9/41)、云南(3/41)4省41個(gè)豬場(chǎng)共292份疑似PRRS患病保育豬的肺臟(48份)和血清(244份)樣本，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol試劑(RNAiso Plus)、Prime-ScriptTMRT試劑盒、pMD19-T載體、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；QuickTaqHS DyeMix購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[3,8]中的引物序列分別合成擴(kuò)增PRRSV ORF7基因的檢測(cè)引物和擴(kuò)增NSP2基因的PRRSV分型引物，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件根據(jù)類(lèi)NADC30病毒株SD53-1603(MH651744.1)全基因組序列分段設(shè)計(jì)引物(表1)，用于該病毒全基因的擴(kuò)增，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并用ddH2O稀釋至10 pmol/L備用。

1.3 病料樣本、陽(yáng)性樣本PRRSV分型的檢測(cè)及類(lèi)NADC30病毒株基因組的擴(kuò)增 取適量肺臟組織剪碎研磨、離心后，取400 μL上清用于提取核酸，血清樣本則直接取400 μL用于提取核酸。用TRIzol試劑提取上述樣本中的PRRSV總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后于-20℃保存。以292份樣本的cDNA為模板，以O(shè)RF7 F/R為引物進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，并利用分型引物NSP2 F/R對(duì)檢測(cè)出的PRRSV進(jìn)行分型。利用特異性引物(表1)對(duì)分別來(lái)自成都、宜賓、眉山、綿陽(yáng)的經(jīng)NSP2引物鑒定為類(lèi)NADC30病毒株的樣本cDNA進(jìn)行全基因組PCR的分段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃2 min；94℃30 s、54℃30 s、68℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃8 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，并在NCBI中對(duì)全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 類(lèi)NADC30病毒株全基因組特征和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 應(yīng)用MegAlign和CLC sequence Viever 8對(duì)檢測(cè)到的7株類(lèi)NADC30病毒株全基因組和ORF5基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并通過(guò)MEGA 7.0軟件用鄰近法構(gòu)建類(lèi)NADC30病毒株的全基因組及ORF5基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；應(yīng)用SimPlot和RDP4軟件對(duì)7株類(lèi)NADC30病毒全基因組序列進(jìn)行重組分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病料樣品的檢測(cè)及PRRSV陽(yáng)性樣本分型的結(jié)果 通過(guò)對(duì)2018年從我國(guó)西南地區(qū)采集的292份疑似PRRS的臨床樣品經(jīng)PRRSV ORF7基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示共檢出PRRSV陽(yáng)性樣品129份(44.18%，95%confidence interval(CI)=38.4%～50.1%)，肺臟樣品PRRSV檢出率為44.68%(95%CI=30.2%～59.9%，21/47)，血清樣品PRRSV檢出率為44.08%(95%CI=37.8%～50.5%，108/245)。豬場(chǎng)PRRSV檢出率為70.73%(95%CI=54.5%～83.9%，29/41)。與近年來(lái)我國(guó)西南地區(qū)PRRSV的檢出率(22.15%～34.1%)相比明顯上升[1,7]，表明我國(guó)西南地區(qū)PRRSV的感染率呈逐年上升趨勢(shì)。利用NSP2引物對(duì)129份陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有64份陽(yáng)性樣品擴(kuò)增出了PRRSV NSP2基因(49.6%)，通過(guò)測(cè)序后分析該基因編碼蛋白的氨基酸序列可知，有45株在NSP2蛋白中存在不連續(xù)的131個(gè)氨基酸缺失的類(lèi)NADC30病毒株(70.3%，95%CI=57.6%～81.1%)，8株在NSP2蛋白中存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失的HP-PRRSV病毒株(12.5%，95%CI=5.6%～23.2%)，11株為經(jīng)典株(17.2%，95%CI=8.9%～28.7%)，65份未分型成功。有19個(gè)豬場(chǎng)感染的PRRSV被分型，其中14個(gè)豬場(chǎng)存在類(lèi)NADC30病毒株感染(73.7%，95%CI=48.8%～90.9%)。與我國(guó)山東和河北等省份一致，類(lèi)NADC30病毒株已經(jīng)成為我國(guó)西南地區(qū)PRRSV的優(yōu)勢(shì)流行株[9]。提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)我國(guó)西南地區(qū)PRRSV類(lèi)NADC30病毒株分子流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)和對(duì)PRRS的綜合防控。

2.2 7株類(lèi)NADC30病毒株基因組序列分析 對(duì)7份類(lèi)NADC30病毒株樣品分段擴(kuò)增，并在NCBI中對(duì)拼接后的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增的類(lèi)NADC30病毒株基因組序列全長(zhǎng)為14 915 bp～14 961 bp，GC含量為52.63%～52.79%，均在NSP2蛋白存在131(111aa+1aa+19aa)個(gè)氨基酸缺失。根據(jù)病毒株的采集時(shí)間和地理位置分別命名為SWU/MS2/2018、SWU/MS3/2018、SWU/MY5/2018、SWU/MY6/2018、SWU/YB1/2018、SWU/YB2/2018、SWU/CD1/2018，GenBank登錄號(hào)依次為MK429980～MK429986。病毒基因的突變和重組，對(duì)PRRS的防控造成了阻礙。在中國(guó)西南地區(qū)關(guān)于PRRSV的報(bào)道中，類(lèi)NADC30病毒株與強(qiáng)毒株的重組事件頻繁發(fā)生[7]，但本研究中的7株P(guān)RRSV基因組經(jīng)分析均未與任何病毒株發(fā)生重組。7株P(guān)RRSV病毒基因組與30株國(guó)內(nèi)外PRRSV病毒同源性為58.7%～96.4%，與參考株中的類(lèi)NADC30病毒株同源性為85.3%～96.4%，與參考株中的NADC30病毒株(JN654459.1)同源性?xún)H93.4%～93.8%，與山東類(lèi)NADC30病毒株SD53-1606(MH651745.1)的同源性為95.6%～96.4%。7株類(lèi)NADC30病毒NSP2基因進(jìn)化樹(shù)(圖略)、ORF5基因進(jìn)化樹(shù)(圖略)和全基因組進(jìn)化樹(shù)(圖1)均與類(lèi)NADC30病毒株聚為一大支，并且與中國(guó)近兩年報(bào)道的山東病毒株SD53-1606和河北病毒株QHD1(MG687491.1)單獨(dú)聚為一個(gè)分支(圖1)，表明7株病毒均是由類(lèi)NADC30病毒株演化而來(lái)的新病毒。其基因組與NADC30病毒株(JN654459.1)的低同源性表明，我國(guó)西南地區(qū)流行的類(lèi)NADC30病毒株可能出現(xiàn)了新的變異。這提示規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)更加注重生物安全，完善引種程序，避免引入新的類(lèi)NADC30病毒株。

圖1 7株P(guān)RRSV類(lèi)NADC30病毒株全基因組遺傳演化分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 7 PRRSV NADC30-like strains

2.3 7株類(lèi)NADC30病毒株ORF5基因序列分析對(duì)7株類(lèi)NADC30病毒ORF5基因的同源性分析顯示：7株病毒ORF5基因與參考株該基因核苷酸序列同源性為61.4%～97.3%，其編碼蛋白GP5的氨基酸序列與參考株該蛋白氨基酸序列同源性為53.5%～95.5%。對(duì)GP5氨基酸序列分析顯示，7株病毒中的部分病毒株GP5氨基酸序列出現(xiàn)了D54G、Y106R、K166R、V169I等突變，但7株病毒株GP5氨基酸序列中均發(fā)生了一個(gè)氨基酸(S/N33)的缺失。為進(jìn)一步調(diào)查該缺失模式在PRRSV病毒株中的流行情況，將本研究中的7株病毒的ORF5基因序列與已知的395條PRRSV的ORF5基因序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示僅有16株類(lèi)NADC30病毒存在同樣的缺失模式，包括山東病毒株(10/16)、黑龍江病毒株(3/16)、廣西病毒株(1/16)、河北病毒株(1/16)、四川病毒株(1/16)。ORF5基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示22株存在該缺失模式的病毒單獨(dú)聚為一個(gè)分支(圖2)。以上結(jié)果表明存在該缺失模式的病毒可能是類(lèi)NADC30病毒株傳入我國(guó)后遺傳演化而來(lái)的新型病毒株，最早流行于山東地區(qū)，隨后傳入我國(guó)西南地區(qū)，目前已經(jīng)在四川地區(qū)廣泛流行[9]。關(guān)于存在該缺失模式病毒的動(dòng)物試驗(yàn)中，感染存在該缺失模式病毒的仔豬具有呼吸癥狀明顯，發(fā)熱程度更高、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)等臨床特征，表明存在該缺失模式的類(lèi)NADC30病毒株具有較高的致病性[10]，但其具體的致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究調(diào)查了2018年P(guān)RRS在中國(guó)西南地區(qū)的流行情況，數(shù)據(jù)表明類(lèi)NADC30病毒株為我國(guó)西南地區(qū)PRRSV的主要流行株。本研究獲得了7株P(guān)RRSV類(lèi)NADC30病毒株全基因組序列，為分析該類(lèi)病毒株的遺傳進(jìn)化規(guī)律和變異趨勢(shì)、研發(fā)新型有效的疫苗奠定了基礎(chǔ)。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Genetic phylogenetic tree of PRRSV ORF5 gene