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        小鼠腦干3β羥基類固醇脫氫酶1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)檢測(cè)方法的優(yōu)化

        2019-04-17 06:13:30曹曉娟范奎奎劉昊東海日汗杜晨光
        關(guān)鍵詞:多聚甲醛檸檬酸鈉切片

        曹曉娟,李 強(qiáng),范奎奎,潘 登,劉昊東,王 昆,海日汗,杜晨光,*

        (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭014109;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018;3.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所,河北石家莊050000)

        類固醇激素對(duì)生活在各種環(huán)境中的脊椎動(dòng)物適應(yīng)性表型的表達(dá)至關(guān)重要[1]。通常,僅通過測(cè)量循環(huán)激素水平很難發(fā)現(xiàn)激素合成的潛在機(jī)制,因?yàn)檠褐械念惞檀妓讲⒉豢偸桥c組織中的激素水平一致;一些循環(huán)激素需要通過局部表達(dá)的類固醇代謝酶轉(zhuǎn)化為更活躍的代謝物[2-3]。在這些酶中,3β羥基類固醇脫氫酶1(3β-HSD1)在類固醇生成途徑中處于關(guān)鍵位置,在性腺和腎上腺中研究較多。證實(shí)其可將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為黃體酮和脫氫表雄酮(DHEA),再轉(zhuǎn)化為雄烯二酮,進(jìn)而合成雄激素(睪酮)[4]。同時(shí),3β-HSD1也在其它脊椎動(dòng)物組織中表達(dá),包括肝臟、心臟、主動(dòng)脈、腎臟、脊髓和大腦。然而,它的功能最近才得到充分的重視。這種酶對(duì)于將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮、DHEA轉(zhuǎn)化為雄烯二酮是必不可少的,而雄烯二酮又是產(chǎn)生更強(qiáng)大的雄激素的底物,即,睪酮(T)和5a二氫睪酮,它們與雄激素受體緊密結(jié)合發(fā)揮多重生理作用。同時(shí),類固醇激素與肥胖、肥胖引起的高血壓和2型糖尿病等疾病息息相關(guān)[4-6]。

        腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,其包含能量代謝、生殖、內(nèi)分泌等多種調(diào)節(jié)中樞,通過下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸兩條經(jīng)典途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌等諸多穩(wěn)態(tài)[7]。對(duì)鳥類的研究表明,3β-HSD1在大腦中的表達(dá)和活動(dòng),影響鳥類的神經(jīng)行為功能。例如在鳥類大腦中,3β-HSD1與雌激素合成芳香化酶協(xié)同作用,將DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素。這些雌激素進(jìn)而激活神經(jīng)雌激素受體來調(diào)節(jié)社會(huì)行為,例如以循環(huán)睪酮為基礎(chǔ),在非繁殖季節(jié)表現(xiàn)出的雌激素依賴性攻擊行為[8-10]。

        目前,鮮有文章報(bào)道3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腦組織為檢測(cè)對(duì)象,采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。但在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)常規(guī)的腦組織處理方式難以在小鼠腦組織內(nèi)檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)。為此,本實(shí)驗(yàn)擬通過采用不同的固定液預(yù)先灌注小鼠,取其腦組織經(jīng)上述不同固定液固定后制作冰凍切片,封閉前預(yù)處理[1%TritonX-100+0.4%SDS穿孔、10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)及配合使用抗體信號(hào)增強(qiáng)劑(ASE)降低背景]后,經(jīng)免疫組化方法檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布以及不同固定液對(duì)其在小鼠腦組中的陽(yáng)性熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果的影響,以期選擇最佳的固定液,優(yōu)化該免疫組化方法,為進(jìn)一步研究3β-HSD1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的功能,提供檢測(cè)手段。

        1 材料與方法

        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司,經(jīng)自群繁育后(避免近交),獲得適應(yīng)現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的6周齡~8周齡小鼠。固定液[4%多聚甲醛(4%PFA)、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉]及腦組織切片通透液及封閉前預(yù)處理液[1%triton X-100、30%蔗糖、20 mM檸檬酸鈉、抗體信號(hào)增強(qiáng)劑[9](Antibody signal enhancer,ASE,pH=7.4)]由本實(shí)驗(yàn)室配置。標(biāo)準(zhǔn)驢血清白蛋白購(gòu)自Solarbio公司;兔源3β-HSD1單克隆抗體(MAb)、兔源GAPDH MAb、Alexa標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司;IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Jackson公司。

        1.2 小鼠腦組織處理 用于免疫組化試驗(yàn)的12只小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉深度麻醉,使用灌注泵經(jīng)心肺以3.5 mL/min灌注3 min生理鹽水約10 mL,后將其分為3組,4只/組,分別以5 mL/min灌注3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)40 min約200 mL,取各組小鼠腦組織置于相應(yīng)固定液中后固定過夜,修塊后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰凍切片機(jī)對(duì)腦組織冠狀面連續(xù)切片,厚度為30 μm,漂片法洗滌,4℃保存,并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

        用于western blot試驗(yàn)的3只小鼠經(jīng)斷頸迫殺,參照鼠腦立體定位圖譜[8]快速將經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)的有3β-HSD1熒光信號(hào)區(qū)域的腦干中縫蒼白核(RPa),巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(GRN)及臂旁核(PB)取下并凍存于-80℃。

        1.3 不同固定液對(duì)小鼠腦組織內(nèi)3β-HSD1陽(yáng)性信號(hào)影響的檢測(cè) 先前通過文獻(xiàn)查閱及相關(guān)試劑比例的嘗試性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在免疫組化試驗(yàn)中,不同抗原固定方式對(duì)陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)的清晰度及飽滿度有很大的影響[7]。同時(shí)適當(dāng)濃度的檸檬酸鈉在石蠟切片和冰凍切片中的抗原修復(fù)中均有積極作用,但尚未有相關(guān)文章證實(shí)將檸檬酸鈉融入多聚甲醛中會(huì)對(duì)神經(jīng)元熒光信號(hào)的檢測(cè)有積極作用,為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了嘗試。通過摸索比較,篩選出3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)。

        將1.2經(jīng)上述不同固定液灌注小鼠所得腦組織的冰凍切片依次使用本實(shí)驗(yàn)室摸索的封閉前預(yù)處理方式(1%TritonX-100+0.4%SDS-4℃-4 h、10 mmol/L檸檬酸鈉95℃10 min、ASE 4℃2 h)處理。3%標(biāo)準(zhǔn)驢血清蛋白室溫封閉1 h,分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶200)為一抗,以Alexa647標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶2 000)為二抗。經(jīng)免疫組化檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布及不同固定液對(duì)3β-HSD1陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)及神經(jīng)元形態(tài)的影響。

        1.4 小鼠腦組織中3β-HSD1的western blot檢測(cè)將小鼠腦組織的PB、GRN和RPa區(qū)域材料進(jìn)行腦組織蛋白提取[9-10]后,經(jīng)5%~12%SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)印至NC膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶1 000)和兔源抗GAPDH MAb(1∶5 000)為一抗,以IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶20 000)為二抗,經(jīng)westen blot檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦干PB、GRN及Rpa內(nèi)的表達(dá)情況。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 不同固定液對(duì)小鼠腦組織3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)影響的檢測(cè)結(jié)果 在使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的神經(jīng)元分布時(shí),組織處理方式對(duì)于檢測(cè)3β-HSD1的陽(yáng)性熒光信號(hào)影響較大。從抗原的保存效率來看,組織的冰凍切片比石蠟切片可以更有效的保留抗原完整性,因此使用腦組織的冰凍切片經(jīng)免疫熒光染色在科研或病理診斷的應(yīng)用越來越廣泛[11]。冰凍切片需經(jīng)過固定、脫水、切片、通透、抗原修復(fù)、降噪、抗體孵育等多步流程,其中組織的固定、通透以及抗原修復(fù)對(duì)于免疫熒光最終染色結(jié)果影響較大,而固定的目的在于終止組織內(nèi)酶的活性,避免胞體本身的解體,保持其抗原性,在此基礎(chǔ)上將抗原固定在原位[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外較常用的固定液有適當(dāng)比例的福爾馬林、多聚甲醛、丙酮、甲醇等。然而在檢測(cè)某些特定抗體信號(hào)時(shí),常規(guī)的固定液對(duì)最終結(jié)果的檢測(cè)影響較大[14],但目前尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)的固定劑可以完全適用于所有的抗原固定[15]。為此需適當(dāng)調(diào)整固定液內(nèi)的成分以獲得較優(yōu)的染色結(jié)果。

        本研究用到的封閉前預(yù)處理液中的Triton X-100和SDS均是一種非離子表面活性劑,在免疫熒光預(yù)處理步驟中常常被稀釋至一定比例用作細(xì)胞破膜劑,使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合;ASE包含50 mmol/L甘氨酸、0.05%吐溫20、0.1%TritonX-100和1%BSA,經(jīng)鑒定其作為抗體稀釋液可以增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合效率并降低背景色[4];檸檬酸鈉是免疫組化試驗(yàn)時(shí)用到的較為常見的一種抗原修復(fù)液,將腦組織切片內(nèi)加入適當(dāng)比例的檸檬酸鈉經(jīng)加熱煮沸的方式可暴露出被甲醛的醛基遮蔽的部分抗原[16]。但使用檸檬酸鈉熱修復(fù)組織切片后會(huì)導(dǎo)致染色結(jié)果背景色偏高,通過使用ASE[4]可以降低背景色。因此本研究采用的封閉前預(yù)處理方式不僅降低了免疫組化試驗(yàn)中的背景色,而且可以使抗原充分暴露。適宜的固定液能夠獲得較優(yōu)的抗原保存效率,并結(jié)合后續(xù)的預(yù)處理方式使得抗原的暴露更充分,抗原的空間結(jié)構(gòu)更完整。

        本實(shí)驗(yàn)中小鼠腦組織經(jīng)3種固定液灌注及固定后所得腦組織切片統(tǒng)一經(jīng)過相同的封閉前預(yù)處理后,經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示:4%多聚甲醛固定液組,小鼠腦內(nèi)(前腦、腦干)未檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖1A~圖1C);20%甲醇+0.2%丙酮固定液組小鼠后腦腦干的PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)均檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)的分布,但陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)形態(tài)模糊(圖1D~圖1F);4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液組小鼠上述核團(tuán)內(nèi)檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)的分布,且該陽(yáng)性熒光信號(hào)清晰、神經(jīng)元形態(tài)飽滿圓潤(rùn)(圖1G~圖1I)。圖1中D~F和G~I(xiàn)分別是與A~C位置相近的RPa、GRN和PB掃描結(jié)果圖。

        上述結(jié)果表明,4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液灌注小鼠并輔以后續(xù)封閉前預(yù)處理方式,對(duì)檢測(cè)小鼠后腦腦干內(nèi)PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)分布的檢測(cè)有積極意義。因此,對(duì)于一些未知敏感性及表達(dá)位置的組織抗原,應(yīng)進(jìn)行多種固定劑及預(yù)處理方式的篩選,才能得到最佳的染色效果,以免造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果,從而影響檢測(cè)結(jié)果。

        圖1 不同固定液的免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的分布檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Effects of different fixation methotls on the distribution of 3 beta-HSD1 neurons in mouse brain

        2.2 小鼠腦組織中3β-HSD1蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè)結(jié)果 本研究通過western blot進(jìn)一步印證免疫組化結(jié)果,檢測(cè)上述核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示,3β-HSD1在小鼠腦干的RPa、GRN及PB內(nèi)均有表達(dá)(圖2)。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,表明本研究?jī)?yōu)化的免疫組化試驗(yàn)可靠,驗(yàn)證了3β-HSD1在小鼠腦干RPa、GRN及PB內(nèi)神經(jīng)元的分布結(jié)果。

        本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)顯示3β-HSD1在小鼠腦組織內(nèi)的RPA、GRN和PB均有分布,western blot進(jìn)一步證實(shí)了以上3個(gè)核團(tuán)內(nèi)均有3β-HSD1蛋白的表達(dá)。研究表明二型糖尿病和瘦素受體基因敲除小鼠中,類固醇激素如整體膽固醇水平、脂聯(lián)素和甘油三酯等的合成增高,通過檢測(cè)其類固醇激素合成調(diào)節(jié)因子結(jié)果顯示,3β-HSD1 mRNA表達(dá)量顯著增加[13]?;?β-HSD1在類固醇激素合成過程中的作用,以及腦組織內(nèi)RPA、GRN和PB均涉及到激素的合成調(diào)控過程[17-18],推測(cè)3β-HSD1可能在上述3個(gè)核團(tuán)內(nèi)參與類固醇類激素的合成過程。

        圖2 3β-HSD1蛋白在小鼠腦干RPA、GRN、PB核團(tuán)內(nèi)表達(dá)的western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Expression of 3beta-HSD1 protein in RPA,GRN and PB nuclei of mice brain stem

        本研究通過對(duì)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦干中分布的免疫組化試驗(yàn)中的固定液成分以及預(yù)處理方式的改良,促進(jìn)了該實(shí)驗(yàn)中抗原抗體結(jié)合效率,降低了背景著色,提高了染色結(jié)果的清晰度,證實(shí)了3β-HSD1在小鼠腦干神經(jīng)元核團(tuán)內(nèi)的分布,為研究腦干內(nèi)3β-HSD1的功能提供技術(shù)手段。

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