曹曉娟，李 強(qiáng)，范奎奎，潘 登，劉昊東，王 昆，海日汗，杜晨光,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊050000)

類固醇激素對(duì)生活在各種環(huán)境中的脊椎動(dòng)物適應(yīng)性表型的表達(dá)至關(guān)重要[1]。通常，僅通過測(cè)量循環(huán)激素水平很難發(fā)現(xiàn)激素合成的潛在機(jī)制，因?yàn)檠褐械念惞檀妓讲⒉豢偸桥c組織中的激素水平一致；一些循環(huán)激素需要通過局部表達(dá)的類固醇代謝酶轉(zhuǎn)化為更活躍的代謝物[2-3]。在這些酶中，3β羥基類固醇脫氫酶1(3β-HSD1)在類固醇生成途徑中處于關(guān)鍵位置，在性腺和腎上腺中研究較多。證實(shí)其可將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為黃體酮和脫氫表雄酮(DHEA)，再轉(zhuǎn)化為雄烯二酮，進(jìn)而合成雄激素(睪酮)[4]。同時(shí)，3β-HSD1也在其它脊椎動(dòng)物組織中表達(dá)，包括肝臟、心臟、主動(dòng)脈、腎臟、脊髓和大腦。然而，它的功能最近才得到充分的重視。這種酶對(duì)于將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮、DHEA轉(zhuǎn)化為雄烯二酮是必不可少的，而雄烯二酮又是產(chǎn)生更強(qiáng)大的雄激素的底物，即，睪酮(T)和5a二氫睪酮，它們與雄激素受體緊密結(jié)合發(fā)揮多重生理作用。同時(shí)，類固醇激素與肥胖、肥胖引起的高血壓和2型糖尿病等疾病息息相關(guān)[4-6]。

腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其包含能量代謝、生殖、內(nèi)分泌等多種調(diào)節(jié)中樞，通過下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸兩條經(jīng)典途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌等諸多穩(wěn)態(tài)[7]。對(duì)鳥類的研究表明，3β-HSD1在大腦中的表達(dá)和活動(dòng)，影響鳥類的神經(jīng)行為功能。例如在鳥類大腦中，3β-HSD1與雌激素合成芳香化酶協(xié)同作用，將DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素。這些雌激素進(jìn)而激活神經(jīng)雌激素受體來調(diào)節(jié)社會(huì)行為，例如以循環(huán)睪酮為基礎(chǔ)，在非繁殖季節(jié)表現(xiàn)出的雌激素依賴性攻擊行為[8-10]。

目前，鮮有文章報(bào)道3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腦組織為檢測(cè)對(duì)象，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。但在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)常規(guī)的腦組織處理方式難以在小鼠腦組織內(nèi)檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過采用不同的固定液預(yù)先灌注小鼠，取其腦組織經(jīng)上述不同固定液固定后制作冰凍切片，封閉前預(yù)處理[1%TritonX-100+0.4%SDS穿孔、10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)及配合使用抗體信號(hào)增強(qiáng)劑(ASE)降低背景]后，經(jīng)免疫組化方法檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布以及不同固定液對(duì)其在小鼠腦組中的陽(yáng)性熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果的影響，以期選擇最佳的固定液，優(yōu)化該免疫組化方法，為進(jìn)一步研究3β-HSD1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的功能，提供檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，經(jīng)自群繁育后(避免近交)，獲得適應(yīng)現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的6周齡～8周齡小鼠。固定液[4%多聚甲醛(4%PFA)、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉]及腦組織切片通透液及封閉前預(yù)處理液[1%triton X-100、30%蔗糖、20 mM檸檬酸鈉、抗體信號(hào)增強(qiáng)劑[9](Antibody signal enhancer，ASE，pH=7.4)]由本實(shí)驗(yàn)室配置。標(biāo)準(zhǔn)驢血清白蛋白購(gòu)自Solarbio公司；兔源3β-HSD1單克隆抗體(MAb)、兔源GAPDH MAb、Alexa標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司；IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Jackson公司。

1.2 小鼠腦組織處理 用于免疫組化試驗(yàn)的12只小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉深度麻醉，使用灌注泵經(jīng)心肺以3.5 mL/min灌注3 min生理鹽水約10 mL，后將其分為3組，4只/組，分別以5 mL/min灌注3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)40 min約200 mL，取各組小鼠腦組織置于相應(yīng)固定液中后固定過夜，修塊后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰凍切片機(jī)對(duì)腦組織冠狀面連續(xù)切片，厚度為30 μm，漂片法洗滌，4℃保存，并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

用于western blot試驗(yàn)的3只小鼠經(jīng)斷頸迫殺，參照鼠腦立體定位圖譜[8]快速將經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)的有3β-HSD1熒光信號(hào)區(qū)域的腦干中縫蒼白核(RPa)，巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(GRN)及臂旁核(PB)取下并凍存于-80℃。

1.3 不同固定液對(duì)小鼠腦組織內(nèi)3β-HSD1陽(yáng)性信號(hào)影響的檢測(cè) 先前通過文獻(xiàn)查閱及相關(guān)試劑比例的嘗試性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在免疫組化試驗(yàn)中，不同抗原固定方式對(duì)陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)的清晰度及飽滿度有很大的影響[7]。同時(shí)適當(dāng)濃度的檸檬酸鈉在石蠟切片和冰凍切片中的抗原修復(fù)中均有積極作用，但尚未有相關(guān)文章證實(shí)將檸檬酸鈉融入多聚甲醛中會(huì)對(duì)神經(jīng)元熒光信號(hào)的檢測(cè)有積極作用，為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了嘗試。通過摸索比較，篩選出3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)。

將1.2經(jīng)上述不同固定液灌注小鼠所得腦組織的冰凍切片依次使用本實(shí)驗(yàn)室摸索的封閉前預(yù)處理方式(1%TritonX-100+0.4%SDS-4℃-4 h、10 mmol/L檸檬酸鈉95℃10 min、ASE 4℃2 h)處理。3%標(biāo)準(zhǔn)驢血清蛋白室溫封閉1 h，分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶200)為一抗，以Alexa647標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶2 000)為二抗。經(jīng)免疫組化檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布及不同固定液對(duì)3β-HSD1陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)及神經(jīng)元形態(tài)的影響。

1.4 小鼠腦組織中3β-HSD1的western blot檢測(cè)將小鼠腦組織的PB、GRN和RPa區(qū)域材料進(jìn)行腦組織蛋白提取[9-10]后，經(jīng)5%～12%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶1 000)和兔源抗GAPDH MAb(1∶5 000)為一抗，以IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶20 000)為二抗，經(jīng)westen blot檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦干PB、GRN及Rpa內(nèi)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同固定液對(duì)小鼠腦組織3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)影響的檢測(cè)結(jié)果 在使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦組織中的神經(jīng)元分布時(shí)，組織處理方式對(duì)于檢測(cè)3β-HSD1的陽(yáng)性熒光信號(hào)影響較大。從抗原的保存效率來看，組織的冰凍切片比石蠟切片可以更有效的保留抗原完整性，因此使用腦組織的冰凍切片經(jīng)免疫熒光染色在科研或病理診斷的應(yīng)用越來越廣泛[11]。冰凍切片需經(jīng)過固定、脫水、切片、通透、抗原修復(fù)、降噪、抗體孵育等多步流程，其中組織的固定、通透以及抗原修復(fù)對(duì)于免疫熒光最終染色結(jié)果影響較大，而固定的目的在于終止組織內(nèi)酶的活性，避免胞體本身的解體，保持其抗原性，在此基礎(chǔ)上將抗原固定在原位[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外較常用的固定液有適當(dāng)比例的福爾馬林、多聚甲醛、丙酮、甲醇等。然而在檢測(cè)某些特定抗體信號(hào)時(shí)，常規(guī)的固定液對(duì)最終結(jié)果的檢測(cè)影響較大[14]，但目前尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)的固定劑可以完全適用于所有的抗原固定[15]。為此需適當(dāng)調(diào)整固定液內(nèi)的成分以獲得較優(yōu)的染色結(jié)果。

本研究用到的封閉前預(yù)處理液中的Triton X-100和SDS均是一種非離子表面活性劑，在免疫熒光預(yù)處理步驟中常常被稀釋至一定比例用作細(xì)胞破膜劑，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合；ASE包含50 mmol/L甘氨酸、0.05%吐溫20、0.1%TritonX-100和1%BSA，經(jīng)鑒定其作為抗體稀釋液可以增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合效率并降低背景色[4]；檸檬酸鈉是免疫組化試驗(yàn)時(shí)用到的較為常見的一種抗原修復(fù)液，將腦組織切片內(nèi)加入適當(dāng)比例的檸檬酸鈉經(jīng)加熱煮沸的方式可暴露出被甲醛的醛基遮蔽的部分抗原[16]。但使用檸檬酸鈉熱修復(fù)組織切片后會(huì)導(dǎo)致染色結(jié)果背景色偏高，通過使用ASE[4]可以降低背景色。因此本研究采用的封閉前預(yù)處理方式不僅降低了免疫組化試驗(yàn)中的背景色，而且可以使抗原充分暴露。適宜的固定液能夠獲得較優(yōu)的抗原保存效率，并結(jié)合后續(xù)的預(yù)處理方式使得抗原的暴露更充分，抗原的空間結(jié)構(gòu)更完整。

本實(shí)驗(yàn)中小鼠腦組織經(jīng)3種固定液灌注及固定后所得腦組織切片統(tǒng)一經(jīng)過相同的封閉前預(yù)處理后，經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：4%多聚甲醛固定液組，小鼠腦內(nèi)(前腦、腦干)未檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖1A～圖1C)；20%甲醇+0.2%丙酮固定液組小鼠后腦腦干的PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)均檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)的分布，但陽(yáng)性神經(jīng)元信號(hào)形態(tài)模糊(圖1D～圖1F)；4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液組小鼠上述核團(tuán)內(nèi)檢測(cè)到3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)的分布，且該陽(yáng)性熒光信號(hào)清晰、神經(jīng)元形態(tài)飽滿圓潤(rùn)(圖1G～圖1I)。圖1中D～F和G～I(xiàn)分別是與A～C位置相近的RPa、GRN和PB掃描結(jié)果圖。

上述結(jié)果表明，4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液灌注小鼠并輔以后續(xù)封閉前預(yù)處理方式，對(duì)檢測(cè)小鼠后腦腦干內(nèi)PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1陽(yáng)性熒光信號(hào)分布的檢測(cè)有積極意義。因此，對(duì)于一些未知敏感性及表達(dá)位置的組織抗原，應(yīng)進(jìn)行多種固定劑及預(yù)處理方式的篩選，才能得到最佳的染色效果，以免造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，從而影響檢測(cè)結(jié)果。

圖1 不同固定液的免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的分布檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Effects of different fixation methotls on the distribution of 3 beta-HSD1 neurons in mouse brain

2.2 小鼠腦組織中3β-HSD1蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè)結(jié)果 本研究通過western blot進(jìn)一步印證免疫組化結(jié)果，檢測(cè)上述核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，3β-HSD1在小鼠腦干的RPa、GRN及PB內(nèi)均有表達(dá)(圖2)。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，表明本研究?jī)?yōu)化的免疫組化試驗(yàn)可靠，驗(yàn)證了3β-HSD1在小鼠腦干RPa、GRN及PB內(nèi)神經(jīng)元的分布結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)顯示3β-HSD1在小鼠腦組織內(nèi)的RPA、GRN和PB均有分布，western blot進(jìn)一步證實(shí)了以上3個(gè)核團(tuán)內(nèi)均有3β-HSD1蛋白的表達(dá)。研究表明二型糖尿病和瘦素受體基因敲除小鼠中，類固醇激素如整體膽固醇水平、脂聯(lián)素和甘油三酯等的合成增高，通過檢測(cè)其類固醇激素合成調(diào)節(jié)因子結(jié)果顯示，3β-HSD1 mRNA表達(dá)量顯著增加[13]?；?β-HSD1在類固醇激素合成過程中的作用，以及腦組織內(nèi)RPA、GRN和PB均涉及到激素的合成調(diào)控過程[17-18]，推測(cè)3β-HSD1可能在上述3個(gè)核團(tuán)內(nèi)參與類固醇類激素的合成過程。

圖2 3β-HSD1蛋白在小鼠腦干RPA、GRN、PB核團(tuán)內(nèi)表達(dá)的western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Expression of 3beta-HSD1 protein in RPA,GRN and PB nuclei of mice brain stem

本研究通過對(duì)檢測(cè)3β-HSD1在小鼠腦干中分布的免疫組化試驗(yàn)中的固定液成分以及預(yù)處理方式的改良，促進(jìn)了該實(shí)驗(yàn)中抗原抗體結(jié)合效率，降低了背景著色，提高了染色結(jié)果的清晰度，證實(shí)了3β-HSD1在小鼠腦干神經(jīng)元核團(tuán)內(nèi)的分布，為研究腦干內(nèi)3β-HSD1的功能提供技術(shù)手段。