黃文東 楊艷芳 高 琦 李啟森 朱邦豪▲

1.廣東省茂名市人民醫(yī)院藥劑科，廣東茂名 525000；2.廣東省茂名市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東茂名 525000；3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院心腦血管研究中心，廣東廣州 510080

心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）造成的心肌可逆性或不可逆性的損傷是缺血性心臟病最嚴(yán)重的損傷類型，隨著介入和溶栓技術(shù)的廣泛應(yīng)用，I/R導(dǎo)致?lián)p傷目前已成為心血管疾病防治領(lǐng)域的重要問(wèn)題之一[1-3]。川芎嗪（Ligustrazine）是中藥川芎的有效成分之一，有報(bào)道川芎嗪具有清除氧自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞，干擾炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[4-5]。同時(shí)丹參素（Salvia miltiorrhiza）為唇形科植物丹參的干燥根及根莖的有效成分，主要用于治療心血管疾病，如心絞痛、心肌梗死和中風(fēng)[6]，體內(nèi)外研究表明，丹參素具有多種藥理作用，包括舒張冠狀動(dòng)脈、抗凝、保護(hù)心肌缺血損傷、抗心律失常等[7-8]。目前丹參素和川芎嗪廣泛應(yīng)用于臨床上，近年來(lái)出現(xiàn)了丹參川芎嗪注射液等復(fù)方制劑，課題組前期已研究丹參川芎嗪對(duì)大鼠在體心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用[9]，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)構(gòu)建大鼠離體模型，從離體的角度探討丹參川芎嗪對(duì)離體心肌缺血/再灌注損傷的影響，為臨床使用提供理論依據(jù)。

1 資料

1.1 一般資料

選用SPF級(jí)SD雄性大鼠55只，隨機(jī)分為五組（n=11），空白對(duì)照組的體重（265.38±10.44）g，日齡（49.9±1.12）d，模型組的體重（267.72±11.21）g，日 齡（50.2±1.31）d，SLI高 劑 量 組 的 體 重（264.18±12.37）g，日齡（49.1±1.35）d，中劑量組的體重（265.27±11.95）g，日齡（49.8±1.45）d，低劑量組的體重（269.72±10.19）g，日齡（50.3±1.32）d，各組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），具有可比性。購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020。于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證為粵監(jiān)證字2012C012號(hào)）進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑

丹參川芎嗪注射液（吉林四長(zhǎng)制藥有限公司，20170108）。肝素（500U/kg），河北常山生化；戊巴比妥鈉，德國(guó)Merok公司生產(chǎn)；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，購(gòu)于南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。其他試劑購(gòu)于廣州市化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器

PL202-S電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟）；langendorff離體心臟灌流儀（澳洲ADI公司）；高速冷凍離心機(jī)（Beckman，US）；酶標(biāo)儀（MJ Research，US）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠，CN）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠55只，隨機(jī)分為五組（n=11），分別是空白對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、SLI高劑量組（High）、中劑量組（Middle）、低劑量組（Low）。臨用前將受試物溶于灌流液中，使高中低劑量組的終濃度分別為 2.5、1.25、0.625mL/L。

2.2 Langendorff離體心臟模型制備

2.2.1 Krebs-Henseleit（K-H）灌流液配方（mmol/L）[10]NaCl 118.0，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，NaHCO325.0，KH2PO41.2，CaC122.5，葡萄糖 11.0，牛血清蛋白 0.25，PH7.4。

2.2.2 操作步驟 參考已發(fā)表文章[10-11]方法，SD大鼠腹腔注射肝素鈉（50U/kg）行肝素化抗凝，15min后腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，開胸將心臟迅速取出，轉(zhuǎn)移到4℃（K-H）灌流液的玻璃皿中，輕輕擠出殘留血液，同時(shí)快速用線繩將主動(dòng)脈固定于體外灌流的套管上。提前設(shè)定恒溫循環(huán)器（37±0.5）℃，用 95%O2和 5%CO2混合氣體飽的灌流液進(jìn)行恒壓灌流，灌注壓為60mm Hg，在左心室內(nèi)放置球囊連接壓力傳感器測(cè)定心室內(nèi)壓，用蛙心夾夾住心尖部和乳突部連接傳感器檢測(cè)心電圖。模型組用正常灌流液灌注，平衡20min后，停止灌注20min，復(fù)灌60min。給藥組分別在停灌前用含有2.5、1.25、0.625mL/L的灌流液灌注10min后，全心停灌20min，再灌注60min；空白對(duì)照組連續(xù)灌流100min。

2.3 監(jiān)測(cè)指標(biāo)

2.3.1 心功能參數(shù) 使用labchart生物信號(hào)采集儀器記錄各組受試藥物對(duì)左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張壓（LVEDP）、心率（HR）、左心室內(nèi)壓最大上升、下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax）心功能指標(biāo)的影響。

2.3.2 冠脈流量 人工測(cè)量離體心臟的冠脈流量（CF），分別收集缺血前及再灌后 15、30、60min時(shí)1min內(nèi)的冠脈流出液，用量筒測(cè)量體積，單位以mL/min表示。

2.3.3 檢測(cè)冠脈流出液中LDH、CK、SOD、MDA的活性 使用1.5mL離心管收集特定時(shí)間點(diǎn)的冠脈流出液，并快速置于-80℃冰箱凍存。待全部標(biāo)本收集完成后再用相應(yīng)的試劑盒測(cè)定目標(biāo)檢測(cè)物的生物活性。

2.3.4 HE染色切片觀察心肌損傷情況 待離體心臟灌流結(jié)束后摘下大鼠心臟，并將心臟置于4%多聚甲醛的離心管固定3d，然后制成石蠟包埋切片，根據(jù)大鼠心肌紋路連續(xù)切5片，并進(jìn)行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察相應(yīng)組別的心肌情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，兩組以上變量比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)影響

缺血/再灌注后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組的LVSP、HR、±dp/dtmax相較于空白組顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，SLI高劑量組的LVSP在 30min后明顯升高（P=0.022）；SLI高劑量組的LVEDP在缺血/再灌注30min后明顯降低（P=0.003）。SLI高劑量組的±dp/dtmax在缺血/再灌注30min后明顯升高，其中+dP/dtmax與模型組相比（P=0.019），-dP/dtmax與模型組相比（P=0.028），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。缺血/再灌注30min后高劑量組的HR相較于模型組顯著升高（P=0.005），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由此可知SLI能有效改善心肌缺血/再灌注損傷對(duì)心臟舒縮功能的抑制作用。見表1。

表1 SLI對(duì)缺血/再灌注心肌相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）

表1 SLI對(duì)缺血/再灌注心肌相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

指標(biāo) 組別 基準(zhǔn) 復(fù)灌30min LVSP（mm Hg）空白對(duì)照組 110.64±10.16 110.56±15.29模型組 106.99±5.42 80.91±9.48高劑量組 112.34±10.84 91.51±17.08*中劑量組 102.66±10.96 87.59±11.13低劑量組 105.73±16.69 78.93±17.85 F 0.557 2.794 P 0.696 0.041 LVEDP（mm Hg）空白對(duì)照組 10.86±4.96 9.65±3.65模型組 8.06±12.23 33.69±18.48高劑量組 10.16±1.90 24.52±9.23*中劑量組 10.56±7.18 32.83±10.43低劑量組 10.13±15.57 35.31±15.72 F 1.792 6.691 P 0.153 0.000 HR（次/min）空白對(duì)照組 219.43±25.82 220.68±43.72模型組 189.00±27.55 143.18±18.51高劑量組 213.22±45.99 201.92±9.75**中劑量組 198.79±44.44 186.82±9.00*低劑量組 187.15±58.40 159.63±61.18 F 1.039 33.466 P 0.401 0.001+dP/dtmax（mm Hg/s）空白對(duì)照組 3243.92±279.10 3217.43±323.78模型組 3119.23±268.97 1459.09±387.25高劑量組 3161.91±299.43 1705.47±284.33*中劑量組 3050.13±348.50 1637.78±282.72低劑量組 3251.74±322.38 1480.67±501.42 F 0.672 31.460 P 0.783 0.001-dP/dtmax（mm Hg/s）空白對(duì)照組 3550.64±220.89 3528.54±314.50模型組 3379.87±127.87 1643.16±257.81高劑量組 3617.76±195.02 2100.81±147.76*中劑量組 3419.22±155.18 1914.35±341.95低劑量組 3534.28±375.37 1765.13±208.66 F 0.631 33.519 P 0.895 0.001

3.2 冠脈流量的影響

在穩(wěn)定灌流條件下，空白對(duì)照組前后的灌流量基本保持平穩(wěn)，缺氧再?gòu)?fù)灌30min后，與模型組比較，高劑量組有顯著性增加（P=0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而中劑量和低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可知SLI能明顯改善大鼠離體心臟灌流量。見表2。

表2 SLI對(duì)心肌梗死冠脈流量（CF）的影響（±s，mL/min）

表2 SLI對(duì)心肌梗死冠脈流量（CF）的影響（±s，mL/min）

注：與模型組比較，*P＜0.05

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3.3 灌脈流出液中LDH、CK、MDA、SOD的生物活性測(cè)定

各組在停灌前，LDH、CK、SOD、MDA含量值與空白對(duì)照組相比較均無(wú)差異，在缺血處理20min后，再灌注30min時(shí)，SLI高劑量組LDH與模型組相比較（P=0.029），CK 值與模型組相比較（P=0.015），差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），中劑量組和低劑量組再灌注30min時(shí)，與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺血再灌注30min，高劑量組SOD值與模型組相比較（P=0.009）；而再灌注30min的MDA值則明顯降低（P=0.023）。結(jié)果顯示SLI各劑量組均能抑制心肌細(xì)胞LDH釋放，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。見表3。

3.4 HE染色光學(xué)顯微鏡研究SLI對(duì)心肌結(jié)構(gòu)的影響

在顯微鏡下觀察，正常組的心肌細(xì)胞著色均勻，心肌橫紋肌排列整齊，胞膜完整，邊界清晰；模型組心肌細(xì)胞著色不均，纖維排列紊亂，心肌有斷裂，核裂解消失，部分區(qū)域水腫變性，心肌纖維間可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌細(xì)胞壞死。見圖1。

表3 SLI對(duì)大鼠心肌梗死LDH/CK/SOD和MDA的影響（±s）

表3 SLI對(duì)大鼠心肌梗死LDH/CK/SOD和MDA的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

指標(biāo) 組別 基準(zhǔn) 復(fù)灌30min LDH（U/L） 空白對(duì)照組 159.39±32.20 155.63±25.42模型組 145.32±25.21 296.18±18.74高劑量組 162.57±24.97 237.98±26.31*中劑量組 150.32±2.18 297.95±28.72低劑量組 153.74±8.15 287.21±15.86 F 0.571 45.528 P 0.162 0.005 CK（U/L） 空白對(duì)照組 1.42±0.14 1.48±0.91模型組 1.59±0.54 2.24±0.91高劑量組 1.67±0.32 1.64±0.37*中劑量組 1.41±0.28 1.91±0.32低劑量組 1.53±6.74 1.96±0.41*F 0.147 33.551 P 0.179 0.009 SOD（mg/L） 空白對(duì)照組 6.09±1.17 6.63±1.24模型組 5.72±2.15 4.18±1.74高劑量組 6.27±1.97 6.03±1.44**中劑量組 6.02±1.28 5.46±1.72*低劑量組 5.45±1.58 4.87±0.98 F 0.893 25.326 P 0.764 0.048 MDA（nmol/L） 空白對(duì)照組 9.37±0.49 11.76±0.86模型組 8.07±1.19 17.89±1.33高劑量組 9.07±1.42 13.71±1.67*中劑量組 8.65±1.68 15.61±5.32低劑量組 8.98±1.74 15.73±2.10 F 0.442 10.558 P 0.961 0.024

4 討論

心肌缺血/再灌注（I/R）損傷是指心肌缺血后再恢復(fù)血液供應(yīng)，會(huì)引起心肌超微結(jié)構(gòu)不可逆壞死現(xiàn)象。在心肌缺血再灌注過(guò)程中，雖然再灌注能夠改善血液供應(yīng)，但會(huì)引起心肌超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步的損傷而導(dǎo)致病情惡化。目前的研究顯示心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制與自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、微血管損傷等有關(guān)[12-14]，心肌缺血再灌注過(guò)程中由于局部心肌缺血缺氧，在恢復(fù)灌注過(guò)程中氧氣供應(yīng)充足，產(chǎn)生大量的氧離子、氫氧根等，這些成分可能是引起心肌缺血/再灌注損傷的主要因素之一[15-16]。

圖1 不同處理組心肌組織切片的HE染色結(jié)果圖

本課題主要研究SLI對(duì)離體心臟模型的血流動(dòng)力學(xué)以及心肌酶等指標(biāo)的影響，結(jié)果表明SLI能通過(guò)影響血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心率，以提高心肌供氧量，改善心功能。通常胞質(zhì)酶如AST、LDH和CK作為心肌缺血損傷的診斷標(biāo)志物，在誘導(dǎo)細(xì)胞膜滲透或破裂時(shí)，從受損的心肌組織中泄漏到血液中[17-18]。因此，血清中AST、LDH和CK的活性能夠反映膜完整性的改變和心肌損傷的程度。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SLI劑量組依賴性地降低I/R損傷引起的LDH和CK水平升高，提示SLI可以抑制急性心肌缺血損傷的細(xì)胞膜損傷。

據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌損傷的主要原因[19-21]。過(guò)量的氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。SOD是機(jī)體清除氧自由基、減少自由基產(chǎn)生和心肌細(xì)胞H/R損傷的第一道防線。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物，其濃度可以反映心肌損傷程度[22-23]。在我們的研究中，SLI不僅顯著降低了MDA含量，而且增加了SOD酶活性。結(jié)果表明，SLI能增強(qiáng)清除氧化自由基的能力，至少在一定程度上能減少心肌損傷。

本實(shí)驗(yàn)HE染色顯示，模型組心肌損傷引起心肌細(xì)胞膜損傷，心肌壞死、肌腱有斷裂，纖維排列紊亂，核碎裂、消失，胞質(zhì)紅染，呈現(xiàn)不規(guī)則粗顆粒狀，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，染色質(zhì)凝結(jié)、胞質(zhì)空泡和肌纖維丟失。SLI可消除心肌細(xì)胞膜損傷，偶爾出現(xiàn)肌纖維丟失和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯縮小壞死灶，明顯減弱壞死程度。結(jié)果顯示，SLI對(duì)缺血/再灌注的心肌組織具有的一定保護(hù)作用。

綜上所述，我們的研究首次表明，SLI能減輕心肌再灌注所造成的損傷，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)心肌酶對(duì)大鼠心肌I/R損傷具有顯著的心肌保護(hù)作用，增強(qiáng)了清除氧化自由基的能力。