陳敏杰，錢懿宏，于青燕，郭倩，洪智程，徐冬梅

浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015

當(dāng)前，抗生素在人類和動(dòng)物細(xì)菌性感染疾病治療、集約化養(yǎng)殖飼料添加劑中長期廣泛應(yīng)用，其造成的環(huán)境污染已成為人類面臨的重大環(huán)境問題之一[1]。據(jù)報(bào)道，2010年全球抗生素使用量達(dá)到10×104～20×104t[2]；2013年我國抗生素用量(16.2×104t)約占全球總用量的一半，其中獸用抗生素占52%[3]；在美國，獸用抗生素甚至占了抗生素總用量的70%[4]。由于抗生素類藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后僅少數(shù)被吸收代謝，大部分隨糞便尿液排出體外。隨著富含抗生素的畜禽糞便有機(jī)肥和再生水越來越多地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，使得抗生素持續(xù)輸入土壤環(huán)境而造成嚴(yán)重污染[5-6]。四環(huán)素類抗生素(TCs)是具有十二氫化并四苯基結(jié)構(gòu)的一類廣譜抗生素，主要包括四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)等。該類藥物大量使用造成其在畜禽糞便中的高濃度殘留，加之其具有相對(duì)較高的固-液吸附分配系數(shù)，進(jìn)入環(huán)境后更容易在土壤中吸附累積，所以TCs的土壤污染更為突出。我國長江三角洲、珠江三角洲等部分地區(qū)土壤中TCs的含量已超過100 μg·kg-1的環(huán)境生態(tài)毒性效應(yīng)觸發(fā)值[7-8]，其生態(tài)毒性和健康風(fēng)險(xiǎn)已引起廣泛關(guān)注。

抗生素以微生物為作用靶標(biāo)，能殺死或者抑制環(huán)境中某些微生物從而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)都是以微生物活動(dòng)為基礎(chǔ)的?？股刈饔孟拢⑸锘钚院腿郝浣Y(jié)構(gòu)首先出現(xiàn)變化，進(jìn)而影響到土壤植物和動(dòng)物，土壤微生物、酶活性等生物學(xué)指標(biāo)和動(dòng)植物的健康狀況可反映土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量[9-10]。以TC和OTC為研究對(duì)象，采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)法，考察TCs對(duì)土壤微生物、酶活性等生態(tài)指標(biāo)及植物生長的影響，旨在為抗生素類污染物的生態(tài)毒性和潛在健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為采自浙江大學(xué)華家池校區(qū)的菜園土。去除土壤表面的雜草、枯葉和1 cm左右的表層土，采樣深度為20 cm左右。取回的土樣剔除石礫和植物殘?bào)w等雜物之后，立即過2 mm篩，一部分用于測定土壤理化性質(zhì)，剩余土壤置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。供試土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、蛋白胨、瓊脂和葡萄糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司，鸚哥綠豆種子購于張家口億沐農(nóng)業(yè)科技有限公司。甲苯、尿素、檸檬酸、高錳酸鉀和過氧化氫等試劑(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司杭州分公司)均為分析純，水為二次亞沸蒸餾水。

1.2 研究方法

1.2.1 抗生素對(duì)土壤微生物及酶活性的影響試驗(yàn)

向裝有200.00 g供試土壤的棕色瓶中加入TC、OTC的鹽酸水溶液，藥物濃度分別設(shè)置為0、10、20、40、60、80和160 mg·kg-1，每濃度處理3個(gè)重復(fù)。充分混勻后放置在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃避光培養(yǎng)，試驗(yàn)過程中始終保持土壤濕度在最大持水量的50%～60%左右。分別于培養(yǎng)7、14、21、28和35 d取樣進(jìn)行土壤微生物數(shù)量和酶活性等指標(biāo)的測定。分別用LB固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行土壤細(xì)菌、真菌的計(jì)數(shù)[11]；采用靛酚藍(lán)比色法、磷酸苯二鈉比色法和高錳酸鉀滴定法測定土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性[12]。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the tested soil

1.2.2 抗生素對(duì)綠豆種子芽伸長的影響試驗(yàn)

挑選大小一致、健康飽滿的綠豆籽粒，按體積比1∶3加入80 ℃的蒸餾水燙種3 min后，加常溫蒸餾水浸泡24 h，待種子露白后將綠豆轉(zhuǎn)移至直徑為9 cm、鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿6粒[13]。培養(yǎng)皿中分別加入0、20、40、80和160 mg·L-1的TC、OTC溶液4 mL，放入人工氣候箱中避光孵育，每個(gè)濃度處理設(shè)5個(gè)平行，培養(yǎng)設(shè)定溫度為(22±1) ℃，濕度80%±5%，每隔24 h補(bǔ)水一次。分別于48、96和144 h后測定每個(gè)試驗(yàn)組的平均芽長，計(jì)算芽長抑制率。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用origin8.0軟件進(jìn)行處理和作圖，不同濃度暴露組的土壤酶活性、微生物數(shù)量和綠豆芽生長抑制率等采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用means±SD的方法，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TC、OTC對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

抗生素多為微生物殺滅劑，能殺死或者抑制環(huán)境中某些微生物，從而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。由表2中2種TCs對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響可知，TC最小濃度(10 mg·kg-1)組作用7 d后，土壤細(xì)菌數(shù)量即顯著低于對(duì)照組，此后隨TC作用濃度的增大，土壤細(xì)菌數(shù)量變化不明顯。14～35 d期間土壤細(xì)菌數(shù)量隨TC暴露濃度增大而呈現(xiàn)顯著降低的趨勢，不同TC濃度組細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組相比均有顯著差異。但TC濃度增至40 mg·kg-1后，土壤細(xì)菌數(shù)量變化不明顯。OTC對(duì)土壤細(xì)菌的影響趨勢與TC類似，不同暴露時(shí)間的各濃度組土壤真菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，但7～21 d期間20～160 mg·kg-1OTC濃度組間，28 d時(shí)10～40 mg·kg-1組間、80～160 mg·kg-1組間均無顯著性差異。

表3為2種TCs對(duì)土壤真菌數(shù)量的影響。由表可知，除35 d時(shí)OTC的各濃度組外，2種抗生素的各濃度處理組土壤真菌數(shù)量與對(duì)照組均有顯著差異。但整個(gè)作用周期內(nèi)TC的40、80和160 mg·kg-1組間真菌數(shù)量無顯著差異。OTC對(duì)土壤真菌數(shù)量的影響也大致呈現(xiàn)這一變化趨勢。

2.2 TC、OTC對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶直接參與土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量代謝過程。其中，脲酶和磷酸酶在土壤氮、磷元素的循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色；過氧化氫酶作為一種氧化還原酶，能夠?qū)⑼寥来x過程中產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，對(duì)生物體起到保護(hù)作用[14]。圖1、圖2分別為TC、OTC對(duì)土壤脲酶和磷酸酶活性的影響結(jié)果。由圖1可知，在7～35 d的整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，2種TCs對(duì)土壤脲酶活性的影響總體上呈現(xiàn)低濃度激活、高濃度抑制的變化趨勢。其中，20 mg·kg-1的TC作用28 d后脲酶活性為對(duì)照組的1.43倍，激活作用最為明顯；而OTC對(duì)土壤脲酶的最大激活率為36.7%(20 mg·kg-1作用21 d時(shí))。隨著抗生素作用濃度的增大，脲酶活性顯著回落。方差分析結(jié)果表明，TC最大濃度(160 mg·kg-1)作用35 d和OTC(160 mg·kg-1)作用7、14和21 d脲酶活性均被顯著抑制。圖2為2種抗生素對(duì)土壤磷酸酶活性的影響，由圖可知，OTC作用組的土壤酸性磷酸酶活性變化與脲酶相似。而TC作用初期(7、14 d)土壤磷酸酶活性隨抗生素濃度的升高呈現(xiàn)抑制-恢復(fù)-抑制的變化趨勢；作用后期(28～35 d)酶活性則以激活作用為主，尤其以21 d時(shí)最為明顯。

表2 抗生素對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響(×105 CFU·g-1干土)Table 2 Effects of antibiotics on the soil bacteria (×105 CFU·g-1 dry soil)

注：同一行中字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

由圖3為2種TCs作用下土壤過氧化氫酶活性的變化，相同濃度、相同作用時(shí)間條件下TC對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響較OTC更為明顯。TC作用下土壤過氧化氫酶總體上呈先激活后恢復(fù)的變化趨勢，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)20、40 mg·kg-1組的過氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照組，尤其以14 d時(shí)更為明顯；而80、160 mg·kg-1的高濃度組酶活性則又顯著低于對(duì)照組。

圖1 抗生素對(duì)土壤脲酶活性的影響注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effect of antibiotics on soil urease activityNote: Different letters denote significant differences (P<0.05); the same below.

表3 抗生素對(duì)土壤真菌數(shù)量的影響(×105 CFU·g-1干土)Table 3 Effects of antibiotics on the soil fungi (×105 CFU·g-1 dry soil)

注：同一行中字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

2.3 TC、OTC對(duì)綠豆芽的生長抑制

圖4、圖5分別為暴露于TC和OTC 48 h的綠豆芽的生長情況，結(jié)合表4中抗生素不同暴露時(shí)間的綠豆芽生長抑制率和顯著性水平分析數(shù)據(jù)可知，除96 h的作用組外，40 mg·L-1的TC暴露即顯著抑制了綠豆芽生長，此后隨抗生素暴露濃度的升高，芽長抑制率顯著增大。而OTC暴露的情況下，80 mg·L-1濃度組的芽長抑制率才開始顯著高于對(duì)照組。此外，相同濃度、相同暴露時(shí)間條件下的TC對(duì)綠豆芽伸長的抑制作用大于OTC。

圖2 抗生素對(duì)土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig. 2 Effect of antibiotics on soil acid phosphatase activity

圖3 抗生素對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響Fig. 3 Effects of antibiotics on soil catalase activity

圖4 TC對(duì)綠豆芽48 h的生長抑制Fig. 4 Growth inhibition of TC on mung bean sprouts after 48 h exposure

圖5 OTC對(duì)綠豆芽48 h的生長抑制Fig. 5 Growth inhibition of OTC on mung bean sprouts after 48 h exposure

表4 抗生素對(duì)綠豆芽長的抑制率Table 4 The inhibition rate of antibiotics on mung bean sprout growth

注：同一行中字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

3 討論(Discussion)

自20世紀(jì)50年代美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)首次批準(zhǔn)抗生素用作飼料添加劑以來，目前全世界范圍內(nèi)畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素用量已遠(yuǎn)高于人類抗生素使用量[15]。土壤作為抗生素類污染物的最終歸宿地，主要來源是畜禽糞便有機(jī)肥的農(nóng)田施用。2011年，我國畜禽糞便總產(chǎn)生量為21.21億t，其中絕大部分未經(jīng)過處理便直接施于農(nóng)田[16]。張慧敏等[17]采集測定了浙江省北部地區(qū)41個(gè)施用畜禽糞肥和7個(gè)未施糞肥農(nóng)田土壤的抗生素含量，發(fā)現(xiàn)施用糞肥的農(nóng)田表層(0～20 cm)土壤中TCs總含量的平均值為570 mg·kg-1，未施糞肥土壤的TCs含量為21 μg·kg-1。Hamscher等[18]甚至檢測到施用液體糞肥的農(nóng)場土壤中TC濃度高達(dá)300 mg·kg-1。高濃度的抗生素殘留不僅嚴(yán)重干擾土壤微生物結(jié)構(gòu)群落和活性，也會(huì)通過蓄積作用影響植物生長，進(jìn)而對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[19]。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·kg-1OTC作用下，小麥根際土壤微生物結(jié)構(gòu)群落顯著減少，細(xì)菌、放線菌數(shù)量分別減少了22.2%和31.7%，堿性磷酸酶活性的抑制率達(dá)41.3%。筆者的研究結(jié)果表明，10 mg·kg-1TC作用下，土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量減少率最大分別達(dá)80.67%和74.01%，相同濃度OTC暴露后土壤的細(xì)菌和真菌數(shù)量減少率最大分別達(dá)86.91%和57.20%，TCs作為廣譜抗生素顯著抑制土壤微生物生長。同時(shí)可知，土壤細(xì)菌較真菌對(duì)TCs的污染更為敏感，與徐晨光等[21]、張浩等[22]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，除TC對(duì)土壤酸性磷酸酶和OTC對(duì)土壤過氧化氫酶活性主要表現(xiàn)為激活作用外，總體上TC、OTC暴露后土壤酶活性呈低促高抑的變化趨勢。在35 d的作用周期內(nèi)，TC和OTC對(duì)土壤脲酶活性的最大抑制率分別達(dá)到45.75%和32.61%。這可能是由于外源TC和OTC殺滅了部分土壤微生物，致使死亡細(xì)胞的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解、細(xì)胞膜破裂，游離的胞外酶增加，從而使游離胞外酶活性增強(qiáng)。此后，隨著抗生素暴露濃度的進(jìn)一步增大，TC和OTC與土壤酶分子中的活性部位包括巰基和含咪唑的配位體等結(jié)合，形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物，抑制酶的活性中心，使酶活性降低[23]。外源TC、OTC可能通過改變土壤水解酶活性從而影響土壤營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化，對(duì)作物生長形成間接影響。

綠豆芽生長抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，80 mg·L-1的TC、OTC暴露下，綠豆芽的芽伸長被顯著抑制，并且隨著抗生素濃度的增大，芽長抑制率大幅升高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TCs對(duì)植物的毒性作用主要表現(xiàn)在種子萌發(fā)和植物生長行為等方面。Kong等[24]通過水培試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，0.002～0.2 mmol·L-1的OTC暴露下,紫花苜蓿芽和根的生長抑制率分別達(dá)到61%和85%。綠豆芽長生長抑制可能因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成受到抑制或根際微生物死亡導(dǎo)致營養(yǎng)鹽匱乏。劉娣等[25]的土培實(shí)驗(yàn)證明，小白菜對(duì)TCs的敏感性為根長>發(fā)芽率>生物量。TCs可能通過改變植物抗氧化酶的活性，破壞葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制植物光合作用等方式來影響植物的生長發(fā)育[26]。

綜上可知：(1) 低濃度TC和OTC作用下的土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量即顯著降低，土壤細(xì)菌較真菌對(duì)TCs的污染更為敏感。除TC對(duì)土壤酸性磷酸酶和OTC對(duì)土壤過氧化氫酶活性主要表現(xiàn)為激活作用外，總體上TC、OTC作用后土壤酶活性呈低促高抑的變化趨勢。

(2) 80 mg·L-1的TC、OTC暴露下，綠豆芽芽伸長被顯著抑制，并且隨著抗生素濃度的增大，芽長抑制率大幅升高。相同濃度、相同暴露時(shí)間條件下的TC對(duì)綠豆芽伸長的毒性大于OTC。