許玉潔，高亮，陳進林，余明喧，馮寶欣，黃葉梅，梅承芳，曾國驅,*

1. 廣東省科學院廣東省微生物研究所，廣州 510070 2. 華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

大型溞(Daphniamagna)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)，在世界范圍內的淡水水域廣泛分布[1]，是水生生態(tài)系統(tǒng)能量轉化和物質循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)[2-3]。由于敏感性高，繁殖周期短，能夠通過孤雌生殖獲得基因型一致的克隆體[4-6]，大型溞作為化學毒理學評估的推薦物種，廣泛用于水生生物毒性試驗和評價[7]。

實驗室中大型溞的培養(yǎng)可采用天然水體或人工、半人工的培養(yǎng)基。天然水體包括井水、自來水，人工培養(yǎng)基包括Elendt M4培養(yǎng)基、Elendt M7培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基等化學品測試導則推薦的培養(yǎng)基。研究表明，大型溞培養(yǎng)過程中的水質和營養(yǎng)會顯著影響試驗動物的健康狀態(tài)，從而影響毒理試驗的可靠性[8-9]。人工培養(yǎng)基固定的化學組成能夠為大型溞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境，減少由于地域環(huán)境影響產(chǎn)生的差異，有利于提高生態(tài)毒理學評價的可還原性和標準化程度，減少實驗室之間測試結果的差異性。

Elendt M4培養(yǎng)基是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)在化學品測試指南—大型溞急性活動抑制試驗導則(OECD 202-2011)中推薦使用的試驗培養(yǎng)基[10]，也是目前實驗室中較常見的用于大型溞連續(xù)培養(yǎng)和試驗的培養(yǎng)基。由于Elendt M4培養(yǎng)基中含有螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)，在測試樣品中含有重金屬離子時，培養(yǎng)基中的EDTA會與金屬元素形成絡合物。Sorvari和Sillanp??[11]的研究表明，在添加EDTA的情況下，Mn2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+對大型溞的毒性均下降，F(xiàn)e3+的毒性沒有變化，Hg2+的毒性反而升高。Guilhermino等[12]使用Elendt M7、ASTM和EEC這3種培養(yǎng)基進行金屬離子對大型溞的急性活動抑制試驗，結果表明，在含有EDTA的Elendt M7培養(yǎng)基中，Cd2+和Cu2+的毒性都比在不含螯合物的ASTM或EEC培養(yǎng)基中低一個數(shù)量級。因此，在對含重金屬離子或成分不明的樣品進行測試時，推薦去除培養(yǎng)基中EDTA的成分或使用不含EDTA的培養(yǎng)基配方[13-14]。

本研究選擇了美國材料與試驗協(xié)會(American Society for Testing and Materials, ASTM)推薦的ASTM培養(yǎng)基和國際標準化組織(International Organization for Standardization, ISO)推薦的ISO培養(yǎng)基與Elendt M4培養(yǎng)基進行比較。這2種培養(yǎng)基均不含螯合劑，可在進行含重金屬離子的毒性試驗中作為Elendt M4培養(yǎng)基的替代品。試驗通過比較3種培養(yǎng)基對大型溞生長、繁殖和對重鉻酸鉀毒性敏感性的影響，篩選出適合實驗室大型溞培養(yǎng)和毒理學試驗的培養(yǎng)基，為毒理學試驗中培養(yǎng)基的選擇提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗培養(yǎng)基

選用Elendt M4、ASTM和ISO這3種培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基的配制方法見文獻[10,13-14]，主要成分的比較如表1所示。

1.2 試驗生物

大型溞引種于沈陽化工研究院安全評價中心，并在本實驗室參照大型溞測試標準方法進行飼養(yǎng)。試驗開始前親溞分別在3種試驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少21 d并保持孤雌生殖狀態(tài)，選擇出生6～24 h，活潑、健康和大小盡量一致的幼溞進行試驗。

1.3 試驗餌料

羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)，購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，在本實驗室培養(yǎng)。在經(jīng)過滅菌的OECD培養(yǎng)基中接入羊角月芽藻，在(22±2) ℃、4 400～8 800 lx條件下培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長期的藻液，經(jīng)過8 000 r·min-1離心5 min，收集藻細胞，再用去離子水懸浮。測定羊角月芽藻濃縮液的吸光值和總有機碳(total organic carbon, TOC)濃度，獲得TOC濃度(x)-吸光值(y)的線性方程為y=0.0393x+0.0072，R2= 0.9969。

1.4 大型溞繁殖試驗方法

21 d繁殖試驗參照OECD化學品測試準則的標準方法進行[15]，設置3個培養(yǎng)基試驗組，每組10個平行，試驗容器為100 mL燒杯，盛放80 mL試驗培養(yǎng)基及1只幼溞。試驗條件為水溫(20±2) ℃，光暗比16 h∶8 h，光照強度1 000～1 500 lx。試驗期間采用半靜態(tài)試驗系統(tǒng)，每48 h或72 h更新培養(yǎng)基。每天投喂羊角月芽藻，喂食量為0.1～0.2 mg C·d-1。

試驗期間每24 h觀察一次親溞的外觀和存活情況，及時移除生產(chǎn)的幼溞并計算存活幼溞的數(shù)量，記錄親溞的死亡率、所產(chǎn)幼溞的數(shù)量、初次懷卵時間、初次生殖時間和總生殖胎數(shù)。試驗結束后采用游標卡尺測量親溞的體長(從頭盔至殼刺部的長度)。

1.5 重鉻酸鉀對大型溞急性活動抑制試驗方法

分別收集繁殖試驗中各試驗組出生的非頭胎幼溞進行試驗(溞齡為6～24 h)。設置重鉻酸鉀濃度為0.60、0.82、1.11、1.51、2.05和2.79 mg·L-1。采用去離子水配制濃度為100 mg·L-1的重鉻酸鉀母液，分別用Elendt M4培養(yǎng)基、ASTM培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基將母液稀釋至設置濃度后開始試驗。每個濃度4個平行，試驗容器為100 mL燒杯，盛放50 mL試驗溶液，每個燒杯中放置5只的幼溞。試驗條件為水溫(20±1) ℃，光暗比16 h∶8 h，光照強度1 000～1 500 lx。于試驗開始后24 h觀察和記錄溞類的活動與生存情況，發(fā)現(xiàn)死溞及時取出。溞類活動抑制辨認時，輕晃試驗容器，15 s內不能游動則認為活動抑制。

表1 3種培養(yǎng)基主要成分的比較Table 1 Comparative summary of major constituents of three test media

1.6 數(shù)據(jù)處理

對大型溞繁殖試驗的數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗(采用Shapiro-Wilk test檢驗)、方差齊性檢驗(采用Levene’s test檢驗)。在數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且等方差條件下，使用方差分析(ANOVA)檢驗其顯著性差異，并利用多重比較(LSD test，最小顯著差異法)分析處理之間的差異顯著性。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或存在不等方差性時，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)分析其顯著性差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在SPSS 20.0軟件中進行。24 h-EC50值是根據(jù)急性活動抑制試驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件中的Probit Analyze功能分析得到，并通過線性回歸計算得到劑量-效應方程。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 大型溞繁殖試驗

2.1.1 3種培養(yǎng)基對大型溞存活和生長的影響

由表2可知，3種培養(yǎng)基中親溞21 d的死亡率均為0%且親溞的體長無顯著差異(P>0.05)。試驗過程中，3個試驗組的親溞均未觀察到行為異常或體色改變的現(xiàn)象，說明3種培養(yǎng)基對親溞的存活和生長均無負面影響。在水生生物的毒性試驗中，培養(yǎng)基選擇的最低要求是試驗生物在試驗期間能夠在其中健康存活，并且不會出現(xiàn)任何受到抑制的表現(xiàn)(如變色、行為異?；蛩劳?，而更好的培養(yǎng)基則是能夠使水生生物在其中良好的生長和繁殖[14]。3種培養(yǎng)基均能滿足毒性試驗對試驗培養(yǎng)基的基本要求。

2.1.2 3種培養(yǎng)基對大型溞繁殖的影響

Elendt M4培養(yǎng)基中親溞的初次懷卵時間為6～9 d，ISO培養(yǎng)基中親溞的初次懷卵時間為6～8 d，ASTM培養(yǎng)基中親溞初次懷卵時間均為8 d。ASTM培養(yǎng)基中大型溞初次懷卵的時間在統(tǒng)計學中顯著長于Elendt M4培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基(P<0.05)，但其初次懷卵時間均處于另2種培養(yǎng)基初次懷卵的時間范圍之內。大型溞的初次繁殖時間的平均值為ISO > ASTM > Elendt M4，其中ISO培養(yǎng)基中大型溞的初次繁殖時間顯著晚于ASTM和Elendt M4培養(yǎng)基(P<0.05)，說明ISO培養(yǎng)基雖然不影響大型溞的懷卵，卻會影響幼溞的出生，造成產(chǎn)溞延遲。ASTM培養(yǎng)基中親溞初次懷卵時間和初次繁殖時間的標準差均小于另外2種培養(yǎng)基，說明該培養(yǎng)基中親溞繁殖的同步性好于其他2種培養(yǎng)基。結果如圖1所示。

圖1 親溞初次懷卵時間和初次繁殖時間注：*表示與空白對照組(Elendt M4培養(yǎng)基)差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Time to the presence of the fist eggs and production of first brood of Daphnia magnaNote: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

由圖2可知，親溞的初次產(chǎn)溞數(shù)從大到小依次為Elendt M4 > ASTM > ISO。其中，ISO培養(yǎng)基的初次產(chǎn)溞數(shù)顯著低于Elendt M4培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基(P<0.05)。ISO培養(yǎng)基中親溞的繁殖胎數(shù)和每胎產(chǎn)溞數(shù)均顯著低于另外2種培養(yǎng)基(P<0.05)。這說明，ISO培養(yǎng)基不僅會推遲親溞的繁殖時間，導致繁殖胎數(shù)減少，也會降低每次親溞的產(chǎn)溞數(shù)，從而降低了大型溞的總產(chǎn)溞數(shù)。由表2可知，3種培養(yǎng)基中親溞的總產(chǎn)溞數(shù)由大到小依次為Elendt M4 > ASTM > ISO，其余2種培養(yǎng)基與Elendt M4培養(yǎng)基均差異顯著(P<0.05)。3種培養(yǎng)基中親溞的總產(chǎn)溞數(shù)均大于60只/親溞，滿足OECD對大型溞繁殖試驗的質量控制標準[15]。在試驗過程中，ISO培養(yǎng)基中觀察到死胎的現(xiàn)象，說明ISO培養(yǎng)基對大型溞的繁殖具有很明顯的傷害作用。

表2 大型溞繁殖試驗中生長、繁殖指標Table 2 Growth and reproduction parameters in Daphnia magna reproduction test

注：*表示與空白對照組(Elendt M4培養(yǎng)基)差異顯著(P<0.05)。
Note: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

圖2 親溞初次產(chǎn)溞數(shù)、每胎產(chǎn)溞數(shù)和繁殖胎數(shù)注：*表示與空白對照組(Elendt M4培養(yǎng)基)差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Number of living offspring in first brood and per brood, and the total number of broodsNote: * indicates significant differences with blank control (Elendt M4 medium) (P<0.05).

Elendt M4培養(yǎng)基中大型溞的繁殖胎數(shù)、每胎繁殖量和總繁殖量均高于另2種培養(yǎng)基，說明Elendt M4培養(yǎng)基在3種培養(yǎng)基中最適合大型溞的長期培養(yǎng)和繁殖。Klüttgen等[16]指出，由于人工培養(yǎng)基無法完全模擬大型溞的天然生存環(huán)境，因此，無法排除在長期培養(yǎng)中會對大型溞的生長和繁殖產(chǎn)生負面影響。為了克服這個問題，許多研究者采取添加有機提取物[8,14]或天然水體[17]的方法，而這又會產(chǎn)生因試驗培養(yǎng)基不完全一致而影響試驗標準化的問題。Elendt M4培養(yǎng)基作為一種標準化培養(yǎng)基，含有螯合劑、維生素和豐富的微量元素，能夠較大程度地提供大型溞生長繁殖所需的營養(yǎng)，因此，能夠取得較好的培養(yǎng)、繁殖效果。ISO培養(yǎng)基的主要成分與Elendt M4相同，但由于配方單一，大型溞的繁殖胎數(shù)和繁殖量均顯著低于Elendt M4培養(yǎng)基，且在試驗過程中出現(xiàn)死胎，說明ISO培養(yǎng)基并不適合大型溞的長期培養(yǎng)。ASTM培養(yǎng)基中大型溞懷卵較晚，繁殖胎數(shù)和每胎繁殖數(shù)等繁殖指標略低于Elendt M4培養(yǎng)基，但與其沒有顯著差異(P>0.05)，繁殖總數(shù)低于Elendt M4但高于ISO培養(yǎng)基(P<0.05)且能夠滿足質量控制要求。這說明，相比于ISO培養(yǎng)基，ASTM培養(yǎng)基是Elendt M4培養(yǎng)基在大型溞的長期培養(yǎng)或繁殖試驗中更好的替代品。ASTM培養(yǎng)基中雖然不含有螯合劑，但添加了維生素B12和Se元素，一定程度上補充了大型溞生存所需的營養(yǎng)元素，這可能是ASTM培養(yǎng)基中大型溞繁殖量較高的原因。

2.2 急性活動抑制試驗

由表3可知，重鉻酸鉀對大型溞的急性試驗結果表明，Elendt M4培養(yǎng)基中大型溞的24 h-EC50為1.29 mg·L-1，95%置信限為1.16～1.43 mg·L-1；ASTM培養(yǎng)基中大型溞的24 h-EC50為1.84 mg·L-1，95%置信限為1.66～2.05 mg·L-1；ISO培養(yǎng)基中大型溞的24 h-EC50為0.772 mg·L-1，95%置信限為0.637～0.889 mg·L-1。3種培養(yǎng)基中大型溞對重鉻酸鉀的24 h-EC50值均在0.6～2.1 mg·L-1范圍內，滿足OECD對大型溞急性活動抑制試驗的質量控制標準[10]，因此，都可用于大型溞的急性活動抑制試驗。3種培養(yǎng)基的大型溞對重鉻酸鉀的敏感性大小為：ISO > Elendt M4 > ASTM。3組培養(yǎng)基的空白對照組中大型溞的活動抑制率均為0%，試驗過程中3種培養(yǎng)基的空白對照組中大型溞均未出現(xiàn)體色改變、困于液面等異常現(xiàn)象，說明3種培養(yǎng)基在大型溞的短期試驗中對其沒有抑制作用。

表3 重鉻酸鉀對大型溞的EC50值和濃度-效應曲線Table 3 The EC50 value and concentration-response curve of potassium dichromate on Daphnia magna

本研究結果表明，不同培養(yǎng)基中大型溞產(chǎn)生的子代對重鉻酸鉀的敏感性有著明顯的差別。因此，在設計試驗時需要考慮到不同培養(yǎng)基中大型溞敏感性的不同，對不同研究進行橫向比較時也應考慮到采用不同培養(yǎng)基對試驗結果的影響。

2.3 毒理試驗中對培養(yǎng)基的選擇

目前在進行金屬離子對大型溞的毒性效應試驗時，研究者主要采用曝氣除氯自來水作為試驗培養(yǎng)基[18-19]。自來水成分的不確定性以及受地域差異的影響，不利于試驗的標準化和不同實驗室之間研究結果的比較。一些大型溞急性活動抑制試驗也會采用ISO培養(yǎng)基作為試驗培養(yǎng)基[20]。OECD導則中規(guī)定：在進行大型溞的急性活動抑制試驗之前，大型溞需要在與試驗相同的體系下馴養(yǎng)至少48 h，使其適應試驗體系；進行大型溞的繁殖試驗時，則至少需要馴養(yǎng)3周(一代)[15]。在急性活動抑制試驗中，ASTM和ISO這2種培養(yǎng)基對大型溞的活動和生長均無抑制作用。因此，在進行短期馴養(yǎng)和急性活動抑制試驗時，ASTM培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基均可使用。在進行長期馴養(yǎng)或繁殖試驗時，考慮到ISO培養(yǎng)基對親溞繁殖的負面影響，推薦使用ASTM培養(yǎng)基。

綜上所述，本研究考察了3種培養(yǎng)基對大型溞生長、繁殖的影響及其子代對參比物重鉻酸鉀的敏感性。結果表明，進行含有金屬離子樣品的毒理測試時，ASTM培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基均可用于大型溞的短期馴養(yǎng)和急性活動抑制試驗，ASTM培養(yǎng)基還可以用于長期馴養(yǎng)和繁殖試驗。ASTM培養(yǎng)基和ISO培養(yǎng)基中大型溞的繁殖性能和親溞所產(chǎn)的幼溞敏感性試驗的結果均能滿足標準要求，但在對試驗結果進行解釋和比較時仍需要考慮不同培養(yǎng)基中大型溞敏感性不同所導致的差別。