郝麗娜，陳小雪，李秀云

(1.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250022；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000)

白色念珠菌耐藥性的出現(xiàn)給臨床抗感染帶來極大挑戰(zhàn)[1-2]。聯(lián)合用藥抗耐藥真菌是近年來的國際研究熱點(diǎn)[3]。伏立康唑作為新一代三唑類抗真菌藥，已成為治療白色念珠菌感染的一線藥物[4]。在患者重癥感染時，布地奈德與抗真菌藥物有聯(lián)合應(yīng)用機(jī)會。本研究旨在借助大蠟螟感染模型、微量稀釋法測定兩藥聯(lián)用的體內(nèi)、外抗白色念珠菌作用。

1 材料

1.1 菌株 實驗菌株：敏感白色念珠菌2株(CA4、CA8)和耐藥白色念珠菌2株(CA10、CA16)，山東省千佛山醫(yī)院臨床分離。質(zhì)控菌株：白色念珠菌(ATCC10231)，山東大學(xué)藥學(xué)院藥理實驗室惠贈。

1.2 藥品與主要試劑 伏立康唑(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；布地奈德(美侖生物技術(shù)有限公司)；苯唑西林鈉(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；RPMI1640藥粉(北京拜耳生物技術(shù)有限公司)；3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(MOPS，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京欣華綠源科技有限公司)；PAS染色試劑盒(煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司)；3，3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT，美國Sigma公司)。

1.3 昆蟲感染模型 大蠟螟適齡幼蟲(天津惠裕德生物科技有限公司)。

1.4 儀器 G-560E渦旋混合器(美國Si公司)；超凈工作臺(新加坡ESCO公司)；恒溫培養(yǎng)箱(德國MMM公司)；SpectraMax190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Olympus FSX100熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Leica CM1950冰凍切片機(jī)(德國徠卡公司)；50 μL微量注射器(上海高鴿有限公司)。

2 實驗方法

2.1 體外作用測定 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會的標(biāo)準(zhǔn)方法(CLSI，2008 M27-A3)，通過微量稀釋法測定伏立康唑與布地奈德聯(lián)用抗4株白色念珠菌(CA4、CA8、CA10、CA16)的體外作用。經(jīng) RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋后的不同濃度的兩個藥物被分別加到96孔微量稀釋平板的不同微孔中，每個微孔中的菌液終濃度為2×103cfu·mL-1(96孔微量稀釋平板的第12列只加RPMI 1640液體培養(yǎng)基，作為陰性對照)。96孔微量稀釋平板于35 ℃恒溫箱中孵育24 h后，加入XTT繼續(xù)孵育2 h。經(jīng)培養(yǎng)后，使用酶標(biāo)儀(492 nm)讀取各孔OD值。與無藥物干預(yù)孔內(nèi)真菌生長率比較，以抑制80%真菌生長的最低藥物濃度為MIC，使用FICI模型和△E模型共同評價伏立康唑和布地奈德聯(lián)用的體外抗白色念珠菌作用。

FICI模型的計算和判讀標(biāo)準(zhǔn)[5]：FICI=聯(lián)用時A藥的MIC/單用時A藥的MIC+聯(lián)用時B藥的MIC/單用時B藥的MIC(協(xié)同作用：FICI≤0.5，拮抗作用：FICI>4，無關(guān)作用：0.5

△E模型的計算和判讀標(biāo)準(zhǔn)[6]：△E=EA×EB-E聯(lián)用，其中，伏立康唑與布地奈德單用時白色念珠菌的生長率分別是EA和EB，聯(lián)用時白色念珠菌的生長率為E聯(lián)用。

通過 ΣSYN(96孔板中所有正值△E的加和)與 ΣANT(96孔板中所有負(fù)值△E的加和)的加和指標(biāo)來判斷兩藥的相互作用。當(dāng) ΣSYN(正值△E之總和)與 ΣANT(負(fù)值△E之總和)相加為正值時，表示伏立康唑與布地奈德對白色念珠菌有協(xié)同作用，為負(fù)值時，表示伏立康唑與布地奈德對白色念珠菌有拮抗作用(弱的拮抗或協(xié)同作用：|ΣSYN+ΣANT|<100%時，中等的拮抗或協(xié)同作用：100%≤|ΣSYN+ΣANT|≤200%，強(qiáng)的拮抗或協(xié)同作用：|ΣSYN+ΣANT|>200%)。所有實驗在相同實驗條件下重復(fù)3次。

2.2 體內(nèi)作用測定 分別用PBS將適量對數(shù)生長期敏感白色念珠菌(CA4)和耐藥白色念珠菌(CA10)真菌細(xì)胞配制成終濃度為5×108cfu·mL-1的工作菌液，伏立康唑和布地奈德的終濃度均為160 μg·mL-1。為預(yù)防大蠟螟因感染細(xì)菌而影響本次試驗，隨后向配好的白色念珠菌菌液中加入終濃度為2 μg·mL-1的苯唑西林鈉。隨機(jī)選取大蠟螟幼蟲[(0.2±0.02) g]若干只，將其按照隨機(jī)分組原則分為4組(對照組、伏立康唑、布地奈德、伏立康唑+布地奈德)，將其放在無菌培養(yǎng)皿中，各組16只。使用微量進(jìn)樣針通過蟲體的腹足注射10 μL上述菌液，35 ℃培養(yǎng)2～2.5 h使白色念珠菌侵染大蠟螟，再次通過蟲體的另一腹足注射10 μL相應(yīng)的PBS或藥液。接種后，置于35 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)。

2.2.1 大蠟螟生存分析 每組選取16只適齡大蠟螟幼蟲，實驗步驟同“2.2”項下。培養(yǎng)期間，每天對各組存活幼蟲進(jìn)行計數(shù)，共持續(xù)觀察4 d。所有實驗重復(fù)3次。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.2.2 真菌載菌量的測定 每組選取16只適齡大蠟螟幼蟲，實驗步驟同“2.2”項下。培養(yǎng)期間，每24 h從各組幼蟲中隨機(jī)取出3只(死活均可)，于1 mL PBS中制成勻漿后再進(jìn)行梯度稀釋，分別取各稀釋濃度下的10 μL勻漿于固體YPD培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)48 h后對其進(jìn)行菌落計數(shù)。所有實驗在相同實驗條件下重復(fù)3次。進(jìn)行統(tǒng)計分析時使用GraphPad Prism6.0軟件。

2.2.3 大蠟螟病理切片觀察 每組選取16只適齡大蠟螟幼蟲，實驗步驟同“2.2”項下。培養(yǎng)48 h后，分別從各實驗組中隨機(jī)取出1只幼蟲(死活均可)進(jìn)行PAS糖原染色。所有實驗在相同實驗條件下重復(fù)3次。

3 實驗結(jié)果

3.1 體外作用結(jié)果 由表1可以看出，以FICI模型評價藥物作用時，兩個藥物聯(lián)用對兩株耐藥白色念珠菌均有協(xié)同作用，而對兩株敏感白色念珠菌表現(xiàn)為無關(guān)作用；以△E模型評價時，兩個藥物聯(lián)用對兩株耐藥白色念珠菌也有協(xié)同作用，但對兩株敏感白色念珠菌表現(xiàn)為拮抗。上述兩個評價方法共同說明兩個藥物聯(lián)用對耐藥白色念珠菌有明顯的協(xié)同對抗作用，但是對敏感白色念珠菌無協(xié)同作用。

表1 以FICI模型和△E模型評價藥物體外抗白色念珠菌作用

注：MIC：最低抑菌濃度；MICA：伏立康唑單用的最低抑菌濃度；CA：藥物聯(lián)用時伏立康唑的最低抑菌濃度；MICB：布地奈德單用的最低抑菌濃度；CB：藥物聯(lián)用時布地奈德的最低抑菌濃度；FICI：分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)；ΣSYN：96孔板中所有正值△E之和；ΣANT：96孔板中所有負(fù)值ΔE之和。IN：interpretation，解釋；NI：no interaction，無關(guān)作用；SYN：synergism，協(xié)同作用；ANT：antagonism，拮抗作用

3.2 體內(nèi)作用結(jié)果

3.2.1 藥物單用或聯(lián)用對感染大蠟螟的生存率影響 由圖1A可以看出，對于感染CA4的大蠟螟，各組的生存率均無顯著性差異(P>0.05)，說明兩藥聯(lián)用對感染敏感白色念珠菌的大蠟螟生存率無顯著影響；圖1B可以看出，對于感染CA10的大蠟螟，與對照組相比，藥物單用對感染的大蠟螟生存率均無顯著的影響(P>0.05)，但兩藥聯(lián)用組的生存率顯著提高(P<0.05)，說明兩藥聯(lián)用可顯著提高感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟生存率。

A.感染CA4的大蠟螟；B.感染CA10的大蠟螟；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德圖1 藥物單用或聯(lián)用對感染后的大蠟螟生存率的影響

3.2.2 藥物單用或聯(lián)用對感染大蠟螟的載菌量的影響 由圖2A可以看出，對于感染CA4的大蠟螟，各組的載菌量均無顯著性差異(P>0.05)，說明兩藥聯(lián)用對感染敏感白色念珠菌的大蠟螟體內(nèi)載菌量無顯著影響；圖2B可以看出，對于感染CA10的大蠟螟，與對照組相比，藥物單用對感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟的體內(nèi)載菌量均無顯著的影響(P>0.05)，但兩藥聯(lián)用組的載菌量顯著降低(P<0.05)，說明兩藥聯(lián)用可顯著降低感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟體內(nèi)載菌量。

3.2.3 藥物單用或聯(lián)用對感染大蠟螟的組織的影響 組織病理學(xué)切片中的黑色團(tuán)塊是白色念珠菌細(xì)胞及菌絲形成的團(tuán)塊。通過觀察圖3的大蠟螟感染后的病理切片，我們發(fā)現(xiàn)：對于感染CA4的大蠟螟，各組的組織病理學(xué)切片中黑色團(tuán)塊數(shù)量及組織破壞情況均無顯著性差異，說明兩藥聯(lián)用對感染敏感白色念珠菌的大蠟螟的組織病理學(xué)無顯著影響；圖3B可以看出，對于感染CA10的大蠟螟，與對照組相比，藥物單用對感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟的黑色團(tuán)塊數(shù)量及組織破壞情況無顯著性差異，但兩藥聯(lián)用組的黑色團(tuán)塊數(shù)量明顯減少、組織破壞程度差，說明兩藥聯(lián)用可顯著降低感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟的體內(nèi)真菌數(shù)量，從而降低對大蠟螟的組織損傷。

A.感染CA4的大蠟螟；B.感染CA10的大蠟螟；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德圖2 藥物單用或聯(lián)用對感染后的大蠟螟體內(nèi)載菌量的影響

A.感染CA4的大蠟螟；B.感染CA10的大蠟螟。圖中a～c：對照組；d～f：伏立康唑；g～i：布地奈德；j～l：伏立康唑+布地奈德；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德。圖中“—”代表200 μm圖3 藥物單用或聯(lián)用對感染后的大蠟螟組織的影響

4 討論

近年來，白色念珠菌對現(xiàn)有為數(shù)不多的抗真菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，該問題已成為困擾公眾健康和臨床醫(yī)護(hù)人員的一大難題[1-2]。目前臨床可用的抗真菌藥物品種有限，且大多價格昂貴、毒副作用明顯，使得非抗真菌藥物與抗真菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用成為近年來的研究重點(diǎn)[3,7-10]。三唑類抗真菌藥物作為經(jīng)典的抗真菌藥物，臨床應(yīng)用非常廣泛，伏立康唑作為新一代三唑類抗真菌藥，具有生物利用度高、組織分布廣、透過深部組織能力強(qiáng)等特點(diǎn)，備受關(guān)注。

在臨床抗感染治療過程中，一般感染不用糖皮質(zhì)激素，因為目前認(rèn)為糖皮質(zhì)激素本身無抗真菌作用，且具有免疫抑制作用，擔(dān)心應(yīng)用后會引起感染擴(kuò)散或誘發(fā)二重感染。但在臨床上布地奈德與抗真菌藥物有聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)會：在重癥感染時，為了減輕感染造成的炎癥反應(yīng)，通常在抗菌藥物“保駕護(hù)航”下使用糖皮質(zhì)激素，并且臨床上也的確獲得了滿意的效果。

本研究體外結(jié)果顯示，伏立康唑與布地奈德聯(lián)用時，對敏感白色念珠菌表現(xiàn)為無關(guān)或拮抗作用，但對耐藥白色念珠菌有明顯的協(xié)同作用，提示我們找到了一種能夠在體外增加耐藥白色念珠菌對伏立康唑敏感性的藥物-布地奈德。這對克服現(xiàn)有的白色念珠菌耐藥問題有著重大意義。此外，為進(jìn)一步探究伏立康唑與布地奈德聯(lián)用對白色念珠菌的體內(nèi)作用效果，本實驗采用一種新型生物侵染模型-大蠟螟，通過測定感染后大蠟螟的生存率、載菌量以及病理學(xué)組織學(xué)變化3個指標(biāo)對藥物聯(lián)用的體內(nèi)作用進(jìn)行詳細(xì)評價。體內(nèi)研究結(jié)果表明：伏立康唑和布地奈德聯(lián)用時，對感染敏感白色念珠菌的大蠟螟無顯著體內(nèi)療效，但對感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟體內(nèi)療效顯著，不僅能明顯提高其生存率、減慢蟲體內(nèi)真菌的繁殖速度，還可以明顯降低真菌在組織中形成的團(tuán)塊、減少感染對組織的損傷。由此可見，該實驗從生存分析、載菌量、組織學(xué)研究3個方面明確證明了氟伏立康唑和布地奈德聯(lián)用對感染耐藥白色念珠菌的大蠟螟體內(nèi)作用療效，奠定了今后對該藥物組合進(jìn)行哺乳動物藥效研究的基礎(chǔ)。