袁 麗，孫楚楚，黨慶玲，高瑞昌*

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

花色苷是一大類水溶性植物色素，擁有抗氧化、抗癌、改善肝功能、抗心血管疾病、抗炎、保護視力等多種生理作用[1-4]。盡管花色苷已被報道具有多種生物活性，但其生物活性非常低[5]?；ㄉ帐且淮箢惗喾宇惢衔锏目偡Q，具有很活躍的反應特性，穩(wěn)定性差，一旦與原來周圍環(huán)境即植物細胞分離，很快就會降解[6-7]。在眾多影響因素中，pH值對花色苷的影響最為顯著?；ㄉ盏姆€(wěn)定性會隨著pH值的升高而降低，當pH≤2時，花色苷具有較高的穩(wěn)定性，當pH≥7時，穩(wěn)定性非常低[8]。但是，人類小腸腸腔內(nèi)pH值在7.4左右，花色苷會迅速分解，生物利用度大大降低。因此研究者需要創(chuàng)造一個能使花色苷穩(wěn)定的酸性環(huán)境，使其能到達小腸吸收部位。

將花色苷進行包埋是提高花色苷穩(wěn)定性和生物利用度的重要途徑之一。目前對花色苷的包埋途徑主要有3 種：一是利用脂質體進行包埋，但脂質體仍舊存在一些問題，如包封率較低、無法控制釋放藥物的速率和時間、穩(wěn)定性易受環(huán)境影響等[9-10]；二是通過微囊包埋，如利用明膠、海藻酸鈉等各種生物大分子進行包埋，但微囊體系粒徑較大、緩釋效果不理想，不利于花色苷在體內(nèi)的靶向釋放[11-13]；三是通過復乳體系對花色苷進行包埋。W/O/W型復乳是指將內(nèi)水相分散在油相中，再將這個包有水滴的油相分散在水中，以此形成一個兩面三相的結構[14-15]。復乳特殊的結構賦予其優(yōu)良的性能：一是可創(chuàng)造一個物質所需要的內(nèi)水相微環(huán)境，同時隔絕氧、光、酶等，提高內(nèi)水相物質的穩(wěn)定性；二是具有一定的緩釋靶向作用，可將內(nèi)水相物質靶向釋放；三是可以減少某些食品配料用量，如冰激凌等中脂肪的用量[16]。但是復乳本身是一個熱力學不穩(wěn)定體系[17]，易受到制備方法、乳化劑、各相比例、滲透壓等因素的影響。

目前有少量報道認為復乳體系可促進花色苷在小腸部位的釋放[18]，但是所制備的花色苷包封率較低、穩(wěn)定性差。本研究在前期實驗的基礎上，內(nèi)水相以檸檬酸創(chuàng)造pH 2的酸性環(huán)境，提高花色苷的穩(wěn)定性，以聚甘油蓖麻醇酯（polyglyceryl-3 polyricinoleate，PGPR）為油相乳化劑、Span-80/Tween-80復配為親水性乳化劑、黃原膠為穩(wěn)定劑，用兩步法制備復乳，并對其制備工藝、乳化劑配方進行優(yōu)化，再用制備的復乳包埋矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C-3-G），以期制備高穩(wěn)定性的C-3-G納米包埋體系，促進花色苷類物質的廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C-3-G（純度≥90%） 上海精方科學儀器有限公司；黃原膠 上海源葉生物科技有限公司；葵花子油上海福臨門食品有限公司；PGPR 上海佑創(chuàng)實業(yè)有限公司；一水合檸檬酸、氯化鈉、Span-80、Tween-80、無水乙醇、丙酮（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T25分散儀 德國IKA公司；萬分之一天平、電子稱德國賽多利斯公司；85-1磁力攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；TGL-16gR飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學儀器廠；UV1600紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；DISCOVERY HR-1流變儀 美國TA儀器公司；90PLUS高靈敏度Zeta電位及粒度分析儀 美國布魯克海文公司；FE 20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；光學顯微鏡 上海光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 制備工藝對復乳性質的影響

在前期預實驗的基礎上，采用兩步法制備復乳。先將內(nèi)水相與含有乳化劑的油相高速剪切均質，制備初乳。再將初乳與含有乳化劑的外水相剪切均質，制備復乳。復乳制備的初始工藝和配方為：初乳攪拌速率7 000 r/min、復乳攪拌速率3 500 r/min、內(nèi)水相為pH 2的檸檬酸溶液、初乳水-油質量比3∶7、油相為葵花籽油、油相乳化劑為質量分數(shù)10% PGPR、外水相為蒸餾水、外水相親水乳化劑為Span-80/Tween-80復配、親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值為10、質量分數(shù)10%、初乳與外水相質量比3∶7。

1.3.1.1 初乳攪拌速率對復乳性質的影響

控制其他因素如初始工藝和配方不變，設置初乳攪拌速率為7 000、11 000、15 500、20 000 r/min，考察初乳攪拌速率對初乳離心保留率、初乳流變性、復乳離心保留率、復乳流變性和復乳顯微結構等性質的影響，并選出最優(yōu)初乳攪拌速率。

1.3.1.2 復乳攪拌速率對復乳性質的影響

控制其他因素如初始工藝和配方不變，復乳攪拌速率為3 500、7 000、11 000 r/min，初乳攪拌速率為15 500 r/min，考察復乳攪拌速率對復乳離心保留率、復乳流變性和復乳顯微結構等性質的影響，并選出最優(yōu)復乳攪拌速率。

1.3.2 乳化劑對復乳性質的影響

1.3.2.1 油相PGPR添加量對復乳性質的影響

油相乳化劑P G P R添加量（質量分數(shù)，以下同）為6%、8%、10%、12%、14%，初乳攪拌速率15 500 r/min、復乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質量分數(shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察PGPR添加量對初乳離心保留率、初乳流變性、復乳離心保留率、復乳流變性和復乳顯微結構等性質的影響，并選出最優(yōu)PGPR添加量。

1.3.2.2 外水相乳化劑HLB值對復乳性質的影響

外水相乳化劑HLB值為7.5、8、8.5、9.5、10、12、14，初乳攪拌速率15 500 r/min、復乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質量分數(shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察外水相乳化劑HLB值對復乳離心保留率、復乳流變性和復乳顯微結構等性質的影響，并選出最優(yōu)HLB值。

1.3.2.3 外水相乳化劑添加量對復乳性質的影響

外水相乳化劑添加量為4%、7%、10%、13%、16%，初乳攪拌速率15 500 r/min、復乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質量分數(shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%、外水相乳化劑HLB值9.5，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察外水相乳化劑添加量對復乳離心保留率、復乳流變性和復乳顯微結構等性質的影響，并選出外水相乳化劑最優(yōu)添加量。

1.3.3 乳化劑均勻設計優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，初乳攪拌速率15 500 r/min、復乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質量分數(shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%、外水相乳化劑HLB值9.5、外水相乳化劑添加量13%、外水相黃原膠添加量2%，初乳與外水相質量比5∶5，采用均勻設計試驗組合，對油相乳化劑和外水相乳化劑對復乳穩(wěn)定性綜合影響進行研究，按均勻設計試驗U7（74）對油相乳化劑PGPR添加量、外水相乳化劑（Span-80/Tween-80）HLB值、外水相乳化劑（Span-80/Tween-80）添加量進行優(yōu)化。

1.3.4 復乳離心保留率

單因素試驗時，將制備的復乳1 500 r/min離心15 min，測定乳化層的體積。均勻設計試驗時，將復乳3 000 r/min離心15 min，測定乳化層的體積。離心保留率根據(jù)公式（1）計算：

1.3.5 流變性測定

選擇40 mm平行夾具，設置間距為1 000 μm，選擇Flow-Sweep模式，剪切速率范圍為1～100 s-1，剪切時間為60 s，溫度為25 ℃，將樣品置于樣品臺上，修邊后進行測量。

1.3.6 顯微結構觀察

單因素試驗時取少量制備好的復乳于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡觀察復乳結構，并用顯微鏡自帶拍攝系統(tǒng)拍照。

C-3-G包埋實驗時取少量復乳稀釋20 倍再于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡觀察復乳結構，并用顯微鏡自帶拍攝系統(tǒng)拍照。

1.3.7 C-3-G含量測定

取一定量不含C-3-G的復乳，用蒸餾水稀釋2 倍，500 r/min離心30 min，棄去上層，取下層水相，將下層水相按質量比1∶1與有機試劑混合破乳，振蕩5 min（其中有機試劑為無水乙醇與丙酮按體積比1∶1配制）。破乳后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上層，按質量比1∶1用pH 2檸檬酸溶液酸化制得對照組溶劑。準確稱取1 mg C-3-G溶于溶劑，并定容至10 mL，分別取不同質量的上述C-3-G溶液稀釋，得到質量濃度為50、25、10、5、1 mg/L和0.5 mg/L的C-3-G溶液，在波長533 nm處測定吸光度，以質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得到回歸方程：y=0.023 1x+0.049 6，相關系數(shù)R2=0.994 3，表明C-3-G質量濃度和吸光度在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1.3.8 包封率的計算

取一定量復乳，用蒸餾水稀釋，500 r/min離心30 min，棄去上層，取下層水相，將下層水相按質量比1∶1與有機試劑混合破乳，振蕩5 min（其中有機試劑為無水乙醇與丙酮按體積比1∶1配制）。破乳后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上層，按質量比1∶1用pH 2檸檬酸溶液酸化，于533 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算C-3-G含量。包封率根據(jù)公式（2）、（3）進行計算：

外水相泄露的C-3-G的量/μg=C測量值×n1×n2×m1（3）

式中：n1為C-3-G溶液在黃烊鹽化時被稀釋的倍數(shù)，本實驗中為2；n2為破乳時C-3-G溶液被稀釋的倍數(shù)，本實驗中為2；C測量值為C-3-G含量/（μg/g）；m1為復乳稀釋后外水相加蒸餾水的質量/g。

1.3.9 電位、粒徑的測定

制備樣品后，用蒸餾水稀釋1 000 倍后立即測定粒徑和電位，參數(shù)設置為：He-Ne光源，功率為5 mW，波長為640 nm，散射角90°，測試時間3 min，測定溫度25 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

利用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有實驗均最少為3 次重復，計算結果均以 ±s表示。圖像采用顯微鏡配套的ScopeImage 9.0（H5D）軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 制備方法對復乳性質的影響

2.1.1 初乳攪拌速率對乳液性質的影響

表1 初乳攪拌速率對乳液離心保留率的影響Table 1 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on retention rate of emulsions after centrifugation

圖1 初乳攪拌速率對初乳流變性的影響Fig. 1 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on emulsion viscosity

圖2 初乳攪拌速率對復乳流變性的影響Fig. 2 Effect of stirring rate for second emulsification on emulsion viscosity

圖3 初乳攪拌速率對復乳顯微結構的影響（10×40）Fig. 3 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

初乳攪拌速率會影響內(nèi)水相的粒徑從而對復乳性質產(chǎn)生影響。如表1所示，隨初乳攪拌速率的增加初乳的離心保留率增加，當初乳攪拌速率達到15 500 r/min時離心保留率最大，達到99.04%，當初乳攪拌速率繼續(xù)增加，初乳離心保留率不再增加。由圖1～3可看出，隨初乳攪拌速率增加，初乳粒徑減小，黏度增加。乳化過程的本質是剪切力所產(chǎn)生的黏力克服拉普拉斯壓力梯度，使分散相發(fā)生形變[19]。拉普拉斯壓力梯度與粒徑有關，粒徑越小，拉普拉斯壓力梯度越大，則分散速率增加，產(chǎn)生的黏性力增加，所能克服的拉普拉斯壓力梯度越大，粒徑越小。隨初乳攪拌速率的增加，復乳離心保留率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在初乳攪拌速率為15 500 r/min時達到最高，為57.82%，可見此時初乳的攪拌速率制備復乳最為合適。Yang Yang等[20]研究也表明，初乳攪拌速率與內(nèi)水相液滴分散程度密切相關，直接影響初乳和復乳的性質。初乳攪拌速率降低，則初乳粒徑較大，黏度減小，制備復乳時容易被破壞，而初乳攪拌速率增加，初乳黏度則過大不適于制備復乳時的分散。

2.1.2 復乳攪拌速率對乳液性質的影響

表2 復乳攪拌速率對乳液離心保留率的影響Table 2 Effect of stirring rate for second emulsification on the retention of emulsions

圖4 復乳攪拌速率對復乳流變性的影響Fig. 4 Effect of stirring rate for second emulsification on viscosity of multiple emulsions

圖5 復乳攪拌速率對復乳顯微結構的影響（10×40）Fig. 5 Effect of stirring rate for second emulsification on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

如圖5所示，攪拌速率越大油滴越小。Schuch等[21]研究表明油滴的大小會影響復乳的包封率，油滴越大包封率越高。同時復乳攪拌速率也會影響乳液的流變性（圖4），隨剪切速率的增加，復乳黏度呈先平穩(wěn)后下降。根據(jù)球形顆粒懸浮剪切黏度半經(jīng)驗方程，復乳的黏度會隨著體系中內(nèi)水相和油相所占比例的增加而增加[22]。當復乳攪拌速率小于7 000 r/min時，初乳結構未遭到破壞，黏度變化不大，當復乳攪拌速率為11 000 r/min時，可能是因為部分初乳被破壞，內(nèi)水相合并到外水相中，使體系中內(nèi)水相和油相所占比例減小，導致黏度降低。而復乳的粒徑和黏度又會影響復乳的穩(wěn)定性，如表2所示，隨復乳攪拌速率增加，復乳的離心穩(wěn)定性先上升后趨于平穩(wěn)。由此可見，復乳攪拌速率可能是通過影響油滴大小影響體系的穩(wěn)定性。但這并不意味著制備復乳時攪拌速率越高越好，過高的攪拌速率會破壞初乳的結構，最終形成水包油型單層乳液。從圖5可以看出，復乳攪拌速率達到11 000 r/min時，部分顆粒已經(jīng)失去內(nèi)水相，說明復乳攪拌速率過大已經(jīng)破壞了初乳的結構，Vilanova等[23]研究結果也表明復乳攪拌速率應低于初乳，可防止對初乳結構的破壞。綜上，本實驗條件下復乳攪拌速率為7 000 r/min最合適。

2.2 乳化劑對復乳性質的影響

2.2.1 PGPR添加量對乳液性質的影響

表3 PGPR添加量對乳液離心保留率的影響Table 3 Effect of PGPR content on retention rate of emulsions after centrifugation

圖6 PGPR添加量對初乳流變性的影響Fig. 6 Effect of PGPR content on viscosity of primary emulsions

圖7 PGPR添加量對復乳流變性的影響Fig. 7 Effect of PGPR content viscosity of multiple emulsions

圖8 PGPR添加量對復乳顯微結構的影響（10×40）Fig. 8 Effect of PGPR content on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

PGPR是一種常用的親脂性乳化劑，其含量對復乳性質有顯著影響，含量過低時界面膜極性較大，不能形成復乳，含量過高導致初乳黏度過高，不利于復乳的制備[24]。如表3所示，在實驗PGPR添加量范圍內(nèi)，PGPR添加量雖然對初乳的離心保留率影響不大，都保持在99%，但隨其添加量的增加，復乳離心保留率出現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，在14%時已達到最高（76.17%），因此14%已經(jīng)滿足形成復乳的條件。

由圖6可知，PGPR添加量對初乳黏度影響顯著，初乳黏度隨著PGPR添加量的增加而增加，因為PGPR本身黏度較高，增加整個油相的黏度。同樣根據(jù)球形顆粒懸浮剪切黏度半經(jīng)驗方程，體系的黏度會隨連續(xù)相黏度的增加而增加[22]。油相黏度增加，即初乳中連續(xù)相黏度增加，所以初乳黏度增加。但PGPR添加量對復乳黏度影響不大（圖7）。

由圖8可知，PGPR添加量會對內(nèi)水相粒徑和復乳粒徑產(chǎn)生影響。內(nèi)水相粒徑隨PGPR添加量的增減而減小，因為在一定范圍內(nèi)PGPR添加量的增加，可降低內(nèi)水相的相互聚集，從而使內(nèi)水相粒徑減小，提高復乳穩(wěn)定性[25]。復乳粒徑隨PGPR添加量增加呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。PGPR添加量處于較低水平時，其添加量的增加降低界面極性，利于復乳的制備；當PGPR添加量過高時會在脂層中形成膠束，使初乳的黏度增大，不利于復乳的制備[26]。

2.2.2 外水相乳化劑HLB值對乳液性質的影響

表4 外水相乳化劑的HLB值對乳液離心保留率的影響Table 4 Effect of external water phase emulsifier HLB on retention rate of emulsions after centrifugation

圖9 外水相乳化劑的HLB值對復乳流變性的影響Fig. 9 Effect of external water phase emulsifier HLB on viscosity of multiple emulsions

圖10 外水相乳化劑HLB值對復乳顯微結構的影響（10×40）Fig. 10 Effect of external water phase emulsifier HLB on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

HLB值是對乳化劑親油親水性質的描述，值越低親油性越強，值越高親水性越強。復合乳化劑有更廣泛的HLB值域，所形成的界面膜更致密[27]，本實驗選擇Span-80和Tween-80的復配作為親水性乳化劑。如表4所示，隨HLB值的增加，復乳離心保留率出現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在9.5時達到最高，為74.67%，因為當HLB值過低時界面極性較大不能形成復乳，乳液大部分還是W/O型簡單乳液；HLB值過高時，一方面形成的復乳顆粒較大，另一方面可能破壞復乳的結構[28]。如圖9所示，隨著HLB值越高，復乳黏度減小，因為HLB值升高，乳液整體親水性增加，流動性增加。從圖10可以看出，當HLB值低于8.5時，不能形成復乳，大部分乳液還是簡單的W/O型，當HLB值繼續(xù)增加，復乳粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，與Schmidts等[28]的研究結果一致，在9.5時，粒徑達到最低。當HLB≥9.5時，離心保留率變化趨勢與粒徑變化趨勢一致。綜上，本實驗外水相HLB值選為9.5。

2.2.3 外水相乳化劑添加量對乳液性質的影響

表5 外水相乳化劑添加量對乳液離心保留率的影響Table 5 Effect of external water phase emulsifier contents on retention rate of emulsions after centrifugation

圖11 外水相乳化劑添加量對復乳流變性的影響Fig. 11 Effect of external water phase emulsifier contents on viscosity of multiple emulsions

圖12 外水相乳化劑添加量對復乳顯微結構的影響（10×40）Fig. 12 Effect of external water phase emulsifier content on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

如表5所示，外水相乳化劑添加量對復乳的形成影響較大，隨外水相乳化劑增加，復乳離心保留率先上升后平穩(wěn)的趨勢，當乳化劑含量增加到13%時，復乳離心保留率為（77.2±0.98）%，之后乳化劑添加量繼續(xù)增加，復乳離心保留率變化不大，乳化劑添加量在一定范圍內(nèi)增加可促進乳液穩(wěn)定性。

如圖11所示，當乳化劑添加量低于10%時，復乳的黏度隨外水相乳化劑添加量增加而降低，此時，界面膜較薄、彈性低、穩(wěn)定性差；當乳化劑添加量高于10%時，形成的復乳界面膜較厚，彈性較高，穩(wěn)定性較高，而此時黏度變化不大，可能是10%已滿足復乳形成的最低劑量需要。

如圖12所示，當其添加量較低形成的復乳直徑較大，有部分并沒有形成復乳，還是W/O型乳液。當其添加量增加，形成復乳粒徑逐漸減小。乳化劑添加量增加，可形成界面膜的面積增加，而初乳總體積不變，引起復乳粒徑減小，顆粒數(shù)增加[29]，乳化劑添加量增加到13%時粒徑達到最低。若添加量繼續(xù)增加，多余的乳化劑會先在界面堆積，使復乳粒徑增大，當含量高到一定程度后，會在外水相形成膠束，而膠束會吸引一部分乳化劑從界面膜上脫離，不利于乳液的穩(wěn)定[26]。

2.3 乳化劑配方的優(yōu)化結果

油相和外水相乳化劑的親油親水性和添加量對復乳產(chǎn)生重要的影響，它們之間的相互作用不可忽視，有研究表明，親水親油乳化劑HLB值之間比例即親水疏水加權值對復乳的穩(wěn)定性有顯著影響[30]，因此在單因素試驗基礎上對油相乳化劑PGPR添加量、親水性乳化劑Span-80和Tween-80復配的HLB值和添加量進行均勻設計試驗，以復乳離心保留率為響應值，具體設計與結果見表6。

表6 均勻設計試驗U7（74）因素水平設計與結果Table 6 Uniform design in terms of coded and experimental levels with response

利用SPSS 16.0對試驗結果進行二項回歸分析，得方程擬合相關系數(shù)R值為1，決定系數(shù)R2值為1，調(diào)整值為0.98，認為方程擬合度良好。對模型系數(shù)進行檢驗，PGPR添加量和親水性乳化劑添加量交互項（P=0.021＜0.05）、親水性乳化劑的HLB值和親水性乳化劑添加量交互項（P=0.043＜0.05）、親水性乳化劑HLB值的平方項（P=0.025＜0.05）影響顯著，以PGPR添加量為X1、親水性乳化劑的HLB值為X2、親水性乳化劑添加量為X3，得復乳離心保留率回歸方程為：Y=-5 084.13X1X3+68.084X2X3+4 147.448X12。

對方程進行顯著性分析檢驗，分析結果如表7所示，F(xiàn)值為11.254，P值為0.003，回歸模型顯著。根據(jù)方程求解得到最優(yōu)條件：PGPR添加量16%、外水相乳化劑HLB值10、外水相乳化劑添加量10%，復乳離心保留率為85.17%。根據(jù)所得優(yōu)化條件進行優(yōu)化驗證實驗重復3 次，得復乳離心保留率為80.25%。

表7 方程顯著性檢驗Table 7 Significance test

2.4 包埋C-3-G對復乳性質的影響

2.4.1 C-3-G復乳的載藥量和包封率

表8 C-3-G復乳的載藥量和包封率Table 8 Drug-loading rate and encapsulation ef fi ciency of C-3-G multiple emulsion

C-3-G在pH 2的條件下是一種陽離子型，包埋C-3-G可增加復乳內(nèi)水相的滲透壓。Neumann等[32]指出內(nèi)水相滲透壓隨著內(nèi)水相離子濃度的增加而增加，則內(nèi)水相滲透壓會隨內(nèi)水相C-3-G質量濃度增加而增加。Leong等[31]指出內(nèi)水相滲透壓是外水相10 倍時復乳才能達到穩(wěn)定。從表8可以看出，當內(nèi)水相中C-3-G質量濃度高于1 000 mg/L時，隨質量濃度的增加包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在載藥量為1 500 mg/L時，包封率達到最高，為（98.08±1.56）%。因為當C-3-G質量濃度低于1 500 mg/L時滲透壓較低，容易導致內(nèi)水外滲，降低包封率；質量濃度高于1 500 mg/L時，內(nèi)水相滲透壓過高，引起外水內(nèi)滲，最終使復乳粒破裂，降低包封率。當質量濃度低于1 000 mg/L時，內(nèi)水相滲透壓更低，更多的內(nèi)水相滲透到外水相中，可推測其包封率應低于質量濃度為1 000 mg/L時樣品的包封率，由于內(nèi)水相C-3-G添加量低，同時外水相C-3-G在檢測時又被不斷稀釋，故導致檢測結果不準確。綜上，C-3-G復乳最適的載藥量為1 500 mg/L。

2.4.2 包埋C-3-G對復乳特性的影響

表9 包埋C-3-G對復乳粒徑、電位、離心穩(wěn)定性的影響Table 9 Effect of C-3-G loading on particle size, potential and centrifugal stability of multiple emulsion

圖13 包埋C-3-G對復乳流變性的影響Fig. 13 Effect of C-3-G loading on viscosity of multiple emulsions

由表9可知，內(nèi)水相添加C-3-G后，對復乳電位影響不顯著（P＞0.05），對體系黏度影響也不明顯（圖13），但對復乳粒徑和離心保留率有顯著影響。粒徑從517.20 nm增加到688.99 nm，離心保留率從82.74%上升到93.05%?；ㄉ盏募尤胩岣吡藘?nèi)水相的滲透壓，阻止內(nèi)水相向外滲透，提高了粒徑和穩(wěn)定性[32]。

2.4.3 包埋C-3-G對復乳顯微結構的影響

圖14 包埋C-3-G對復乳對復乳顯微結構的影響（10×100）Fig. 14 Effect of C-3-G loading on microstructure of multiple emulsions (10 × 100)

如圖14所示，未包埋C-3-G復乳和包埋C-3-G復乳均呈完整的W/O/W型，表明內(nèi)水相包埋C-3-G并未對復乳結構產(chǎn)生明顯影響。從圖14也可以看出，復乳粒徑顯著小于單因素試驗時的粒徑，可能有兩方面原因，一是乳化劑進行均勻設計優(yōu)化對復乳粒徑有影響，使粒徑降低；二是此處是將復乳稀釋20 倍后再觀察。

2.4.4 C-3-G復乳穩(wěn)定性的影響因素結果

圖15 C-3-G復乳穩(wěn)定性的影響因素Fig. 15 Factors affecting C-3-G multiple emulsion stability

如圖15所示，25 ℃時復乳離心保留率隨時間延長明顯降低，第2天25 ℃無光條件下已經(jīng)下降到67.03%，25 ℃有光條件下降到58.45%，第6天時，25 ℃條件下復乳已經(jīng)分層。而4 ℃下第6天離心保留率依然保持在70%以上的高水平，表明復乳對溫度有著較高的敏感性。Shakeel等[33]研究也表明室溫不利于復乳的穩(wěn)定性。有光條件下復乳離心保留率下降速率明顯高于無光條件下。25 ℃時第4天有光條件下離心保留率為51.39%，無光條件下為63.08%，差異顯著（P＜0.05）。可能是因為C-3-G具有光敏感性，光照條件下易降解，產(chǎn)生醛類和酚酸類產(chǎn)物對復乳體系產(chǎn)生影響，影響體系穩(wěn)定。

圖16 C-3-G復乳不同保存條件下外觀形態(tài)隨時間的變化Fig. 16 Appearance changes of C-3-G double emulsion under different storage conditions

由圖16可知，從外觀形態(tài)上看，C-3-G復乳呈粉紅色。當在常溫下保存到第6天時，復乳已經(jīng)分層，體系破壞。而在4 ℃下保存的樣品，到2 周時形態(tài)未發(fā)生變化，表明復乳在4 ℃下可穩(wěn)定保存2 周。

3 結 論

通過單因素試驗及均勻設計試驗，以復乳離心保留率為考察指標，確定W/O/W復乳制備最優(yōu)工藝條件為：初乳攪拌速率15 500 r/min、復乳攪拌速率7 000 r/min、油相乳化劑PGPR添加量16%、親水性乳化劑HLB值10、親水性乳化劑添加量10%。利用上述復乳體系包埋C-3-G，所得復乳體系載藥量為1 500 mg/L，包封率為98.08%，粒徑為688.99 nm，電位為-27.61 mV，離心保留率為93.05%，達到穩(wěn)定狀態(tài)。本實驗表明復乳體系很好地包裹PGPR，為花色苷類產(chǎn)品開展更廣泛的應用提供理論基礎。