李偉麗，袁 旭，劉玉淑，伍小宇，唐 勇，林洪斌,2，劉 平，丁文武，車振明，吳 韜,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣醬俗稱郫縣豆瓣，距今已有300多年的歷史。它以二荊條紅辣椒、青皮蠶豆、小麥粉為主要原料，通過微生物制曲、前發(fā)酵，再經(jīng)過翻、曬、露等后發(fā)酵工藝釀制而成[1-2]，其制作技藝已經(jīng)列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[3]。郫縣豆瓣具有色澤紅褐油潤、瓣粒香脆、味鮮辣及醬酯香等特點(diǎn)，是川菜食譜中最經(jīng)典的調(diào)味品之一，被譽(yù)為“川菜之魂”。

由于郫縣豆瓣風(fēng)味獨(dú)特，對其風(fēng)味成分的研究受到學(xué)者們廣泛關(guān)注。例如羅靜等[4]采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品中揮發(fā)性呈香物質(zhì)，共檢測出9 個類別超過140 種揮發(fā)性呈香物質(zhì)。劉平等[5]采用氣相色譜-嗅覺測量法及香氣活性值法對郫縣豆瓣中的特征香氣物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共檢測出112 種揮發(fā)性物質(zhì)。隨著研究的不斷深入，傳統(tǒng)的氣相色譜及氣相色譜-質(zhì)譜法在風(fēng)味成分研究上的局限性也逐漸暴露出來，主要存在分離度低、峰容量有限、檢測成分較少等缺陷。全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF MS）是將兩根不同極性固定相的色譜柱以串聯(lián)方式連接在一起，進(jìn)行正交分離。所檢測的成分首先通過第1維色譜柱分離后，經(jīng)調(diào)制器聚焦，然后以脈沖方式進(jìn)入第2維色譜柱進(jìn)行二次分離[6-8]。因而GC×GC-TOF MS具有高分離度、高分辨率、高靈敏度和高峰容量等優(yōu)點(diǎn)，對食品復(fù)雜組分分離鑒定具有顯著的優(yōu)勢。目前GC×GC-TOF MS已成功應(yīng)用于茶[9-10]、香醋[11-12]、白酒[13-14]、豆醬[15]等發(fā)酵食品研究。前人對于郫縣豆瓣的風(fēng)味成分研究集中在酯類、醇類等揮發(fā)性香氣成分，對于非揮發(fā)性成分研究尚鮮見報道。因而，本研究擬采用柱前衍生化法，結(jié)合GC×GC-TOF MS技術(shù)鑒定郫縣豆瓣的風(fēng)味物質(zhì)，為闡明其風(fēng)味物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及工藝優(yōu)化等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 批不同特級豆瓣醬樣品購買于四川省成都市郫都區(qū)超市，生產(chǎn)日期分別為2016年5月、2016年8月和2016年12月。豆瓣醬經(jīng)冷凍干燥后，粉碎過100 目篩，備用。

異丙醇、乙腈（均為色譜純） 德國C N W Technologies公司；吡啶（色譜純） 上海Adamas公司；甲氧銨鹽（分析純） 日本TCI公司；核糖醇（純度≥99%） 美國Sigma公司；衍生化試劑：雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷） 美國REGIS Technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco科技公司；GC×GC-TOF MS系統(tǒng)、7890B GC儀、DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）色譜柱、DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm）色譜柱 美國安捷倫科技公司；PEGASUS 4D TOF MS 美國力可公司；Heraeus Fresco17型離心機(jī)、Forma 900 series型超低溫冰箱美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW型分析天平 德國Sartorius公司；JXFSTPRP-24型研磨儀上海凈信科技有限公司；TNG-T98型真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠；PS-60AL型超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司；DHG-9023A型烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取方法提取

參照Kind等[16]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取粉末樣品100 mg于2 mL EP管中，加入1 mL提取液（異丙醇-乙腈-超純水體積比3∶2∶2），再加入20 μL核糖醇，渦旋30 s。加入磁珠，45 Hz研磨儀處理4 min，超聲10 min（冰水浴），然后4 ℃、12 000 r/min離心8 min。移取0.8 mL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶（甲烷硅基化）中，在真空濃縮器中干燥提取物，然后向干燥后的代謝物中加入200 μL甲氧銨鹽試劑（甲氧銨鹽酸鹽溶于吡啶，20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中50 ℃孵育90 min。最后向樣品中加入200 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷），將混合物50 ℃孵育30 min，然后上機(jī)檢測。所有樣品均重復(fù)3 次。

1.3.2 GC條件

柱系統(tǒng)由兩根色譜柱組成：柱1：DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），柱2：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm），柱子之間通過毛細(xì)管柱連接器連接。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。操作條件：升溫程序從90 ℃開始，保持1 min，以5 ℃/min速率升到170 ℃，再以10 ℃/min速率升到250 ℃，最后以25 ℃/min速率升到300 ℃，保留13 min。進(jìn)樣口采用分流模式，進(jìn)樣量為1.0 μL，隔墊吹掃流速為3 mL/min。

1.3.3 MS條件

采用電子電離源，電子轟擊能量為-70 eV；前進(jìn)樣口溫度為270 ℃，傳輸線溫度為300 ℃，離子源溫度為220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z為33～600，掃描速率為100 spectrum/s，溶劑延遲為0.3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用ChromaTOF軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣成分的GC×GC-TOF MS分析

郫縣豆瓣風(fēng)味成分十分復(fù)雜，樣品需要預(yù)處理才能檢測。目前前處理方法包括固相微萃取方法和液液萃取方法。其中采用固相微萃取方法檢測郫縣豆瓣中的揮發(fā)性香氣成分已有較多文獻(xiàn)報道。例如黃著等[17]采用固相微萃取方法提取郫縣豆瓣醬的揮發(fā)性組分，經(jīng)GC-MS分離鑒定出8 類共計82 種化合物；黃湛等[18]通過頂空固相微萃取方法測定7 個不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品，共檢測出104 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；劉燕等[19]采用固相微萃取方法從干燥的郫縣豆瓣樣品中鑒定出44 種揮發(fā)性物質(zhì)；Li Xiyang等[20]采用固相微萃取方法從傳統(tǒng)郫縣豆瓣和商業(yè)郫縣豆瓣樣品中分別鑒定出56 種和37 種風(fēng)味物質(zhì)。為更好地提取郫縣豆瓣中的風(fēng)味成分，本研究首先對比固相微萃取方法與液液萃取方法提取效率。固相微萃取方法能檢測到856 個化合物，而液液萃取法可以檢測到987 個化合物，因而，本研究采用液液萃取法提取樣品。這與前人研究結(jié)果類似，例如Yao Feng等[21]以白酒為研究對象，采用固相微萃取方法鑒定得到2 178 種成分，而液液萃取方法鑒定得到2 482 種成分，表明液液萃取方法能夠獲得更多的風(fēng)味成分。

在分離過程中，第1維柱子采用非極性柱（DB-5MS）分離，第2維柱子采用中等極性柱（DB-17HT）進(jìn)行正交分離。從圖1可以看出，郫縣豆瓣組分極為復(fù)雜，其一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現(xiàn)象，通過進(jìn)一步的二維色譜分離，共流出的化合物在二維色譜圖中得到較好分離，有利于進(jìn)一步對這些化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性及定量分析。本研究在特級郫縣豆瓣醬樣品中共分離檢測到1 005 個化合物，遠(yuǎn)高于以往研究報道。

圖1 特級郫縣豆瓣醬的3D色譜圖Fig. 1 3D chromatogram of volatile fl avor compounds in special grade Pixian bean paste

2.2 定性分類

本研究首先通過Pegasus 4D色譜分析工作站，結(jié)合Mainlib譜庫、Replib譜庫、NIST譜庫以及Wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析（選擇RSN＞50的色譜峰進(jìn)行分析），選擇相似度大于800。從豆瓣醬樣品中鑒定出218 種物質(zhì)，可將鑒定出的物質(zhì)分為10 類，如圖2所示，分別為有機(jī)酸類、氨基酸類及其衍生物、糖類及其衍生物、醇類、胺類、酯類、酮類、酚類及其他化合物（主要包括含硫化合物、氮雜環(huán)化合物和氧雜環(huán)化合物）。由圖2可知，有機(jī)酸類化合物種類最多，達(dá)到72 種，其次為氨基酸及其衍生物，為40 種。醛類化合物和酚類化合物少，分別為5 種和4 種。

圖2 特級郫縣豆瓣醬中物質(zhì)種類分布Fig. 2 Various classes of volatile components identified in special grade Pixian bean paste

圖3 郫縣豆瓣醬中物質(zhì)的相對含量Fig. 3 Relative contents of various classes of volatile compounds identified in special grade Pixian bean paste

如圖3所示，有機(jī)酸類化合物在郫縣豆瓣醬物質(zhì)基礎(chǔ)中的相對含量最高，占比為30.36%。其次為氨基酸及其衍生物和胺類化合物，分別為26.58%和16.48%。而酮類化合物、醛類化合物和酚類化合物在郫縣豆瓣中的相對含量較少，均小于1.0%。以往郫縣豆瓣揮發(fā)性成分檢測結(jié)果，主要成分是醇和酯[17-20]。本研究通過衍生化技術(shù)增強(qiáng)了一些難以揮發(fā)成分的檢測，因此能夠測定到更多的風(fēng)味成分。例如有機(jī)酸、糖類和氨基酸類等成分檢測。結(jié)合圖2和圖3可知，在特級郫縣豆瓣樣品中，有機(jī)酸類化合物和氨基酸及其衍生物的種類和相對含量均較高，而糖類及其衍生物的種類較多但相對含量卻較少，造成此現(xiàn)象的原因可能是特級豆瓣醬的發(fā)酵時間長，在其發(fā)酵過程中，由于蛋白酶的作用，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生游離氨基酸，美拉德反應(yīng)和Strecker氨基酸降解反應(yīng)又會消耗所產(chǎn)生的游離氨基酸，同時氨基酸還可以通過脫氨作用、轉(zhuǎn)氨作用、聯(lián)合脫氨或脫羧作用，分解成胺類、α-酮酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)可以轉(zhuǎn)變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸[22-23]。而糖類化合物作為微生物發(fā)酵過程的碳源和能源，不斷被微生物消耗產(chǎn)生酸，因此糖類含量較低[24-25]。

2.3 定量分析

如表2所示，有機(jī)酸類化合物是特級郫縣豆瓣醬中含量最高的一類化合物，其中戊二酸和肌酸是含量最高的2 種有機(jī)酸，相對含量分別達(dá)到14.72%和6.65%。醇類化合物中D(+)-阿拉伯糖醇（1.37%）、山梨糖醇（3.11%）和肌醇（1.15%）等物質(zhì)的相對含量較高。15 種胺類化合物中乙酰苯胺（11.58%）和丙二酰胺（3.23%）為主要組成物質(zhì)。22 種糖類及其衍生物中，塔格糖、果糖、麥芽三糖和D-半乳糖含量相對較高。酯類化合物主要物質(zhì)為十七酸甲酯（2.20%）和1-甘油-棕櫚酸酯（0.50%），其余物質(zhì)相對含量均較低（＜0.1%）。4 種酚類化合物、9 種酮類化合物和5 種醛類化合物的相對含量均較低（＜0.1%）。以往報道中豆瓣醬除醇類、酯類、酸類等揮發(fā)性成分外[26]，氨基酸則是豆瓣醬的主要呈味物質(zhì)[27]，其中天冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸，是豆瓣醬中鮮味的主要來源[28]。然而，本實(shí)驗(yàn)中天冬氨酸相對含量很低（＜0.01%，未列出），谷氨酸相對含量為4.04%。其可能原因在于樣品成分不完全一樣，其中丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸為甜味氨基酸[29-30]，對豆瓣醬的風(fēng)味形成有利，在特級郫縣豆瓣醬中的相對含量分別為2.38%、0.67%、0.50%和1.06%。

表2 郫縣豆瓣醬GC×GC-TOF MS分析鑒定出的主要物質(zhì)Table 2 List of main components indenti fi ed in special grade Pixian bean paste by GC ×GC-TOF MS analysis

續(xù)表2

3 結(jié) 論

本研究通過柱前衍生化技術(shù)，增強(qiáng)一些難以揮發(fā)成分的檢測，因此能夠檢測到更多的成分。進(jìn)一步采用GC×GC-TOF MS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對郫縣豆瓣復(fù)雜風(fēng)味成分的分離分析。定性鑒定出包括有機(jī)酸類、氨基酸及其衍生物、糖類及其衍生物、醇類、酯類、酚類、酮類、醛類、胺類及其他類化合物（主要包括含硫化合物、氮雜環(huán)化合物和氧雜環(huán)化合物）在內(nèi)的10 類物質(zhì)共218 種成分。研究結(jié)果為郫縣豆瓣風(fēng)味解析、工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升等提供科學(xué)依據(jù)。