李 曉，范 剛*，任婧楠，張璐璐，潘思軼

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

圓柚酮為倍半萜烯類(lèi)化合物，屬雅檻藍(lán)烷系的雙環(huán)倍半萜酮[1]。圓柚酮在低濃度時(shí)表現(xiàn)出濃郁的柚子香氣，并帶有甜橙、木香香韻，但味苦，其氣味閾值較低，僅為1 μg/L[2]。圓柚酮因具有宜人的柑橘香氣而受到人們的關(guān)注，自其被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，關(guān)于圓柚酮的天然分布、晶體結(jié)構(gòu)及其多種立體異構(gòu)體的香味特征，都得到廣泛的研究[3-4]。圓柚酮價(jià)格十分昂貴，由于它在天然產(chǎn)物中含量很低，而且其具有立體異構(gòu)體，幾乎無(wú)法分離得到，且提取成本很高，所以圓柚酮的提取及應(yīng)用受到很大限制[5-6]。

作為柚味香精的重要成分，圓柚酮常被用于食品飲料及日化產(chǎn)品中，其在飲料中的用量一般為2～6 mg/L；在日化香精配方中，圓柚酮與其他柑橘類(lèi)精油（如苦橙油、香檸檬油等）配合使用，可以增加產(chǎn)品柑橘香調(diào)[7]。近年來(lái)，國(guó)外關(guān)于圓柚酮的研究更加側(cè)重于生理作用及提取工藝。有研究報(bào)道，從益智藥材中分離得到的圓柚酮，在抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍、抑制脂多糖活化等方面具有顯著活性[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)圓柚酮對(duì)玉米象和米象2 種害蟲(chóng)具有驅(qū)蟲(chóng)效果[9]。此外，圓柚酮還對(duì)地下白蟻具有明顯的驅(qū)避和毒性作用，同時(shí)可以降低白蟻體細(xì)胞的脂肪比例[10-12]。謝建春等[13-14]發(fā)現(xiàn)蒸餾萃取法及延長(zhǎng)蒸餾時(shí)間可以提高柚皮油中圓柚酮的含量。除物理方法外，圓柚酮還可以通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行制備。目前主要的合成方法是使用瓦倫西亞橘烯作為底物，使用重鉻酸鹽進(jìn)行氧化，或在叔丁基過(guò)氧化氫存在下使用催化劑進(jìn)行氧化，通過(guò)三步反應(yīng)轉(zhuǎn)化得到圓柚酮[15-17]。

圖1 瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為圓柚酮Fig. 1 Conversion of valencene to nootkatone

采用化學(xué)合成法生產(chǎn)圓柚酮由于使用大量重金屬催化劑，如鉻酸叔丁酯、三氧化鉻等，會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，并存在一定的安全問(wèn)題，且不屬于天然香料，目前已有學(xué)者采用微生物及其代謝酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)研究（圖1）[18-21]。歐洲和美國(guó)食品法規(guī)明確規(guī)定，采用化學(xué)合成法得到的圓柚酮產(chǎn)品不能作為一種天然香料進(jìn)行銷(xiāo)售和使用，而通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的香料被認(rèn)為是天然的。GB 29938—2013《食品用香料通則》規(guī)定通過(guò)酶法或微生物法工藝生產(chǎn)的香料也被認(rèn)為是天然的。近些年來(lái)，隨著人們食品安全意識(shí)的提高，人們更加傾向選擇天然物質(zhì)作為添加劑，這鼓勵(lì)了利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香料的研究工作[22]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)瓦倫西亞橘烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)圓柚酮的研究還很少。本研究旨在通過(guò)比較3 株不同微生物菌種轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生產(chǎn)圓柚酮的效果，篩選適于轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生產(chǎn)圓柚酮的菌種，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，增加瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量，并提高其轉(zhuǎn)化率，降低天然香料圓柚酮的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）、毛霉（Mucor sp.）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 上海生物網(wǎng)菌種保藏中心（RCCC）。

無(wú)水乙醇、磷酸、吐溫80（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓦倫西亞橘烯（＞70.0%） 美國(guó)Sigma公司；圓柚酮（＞97.0%） 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻放置斜面。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。高溫滅菌后倒平板。

蛋白胨培養(yǎng)基：1.5%蔗糖，1.5%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1% K2HPO4，0.05% KCl，0.001% FeSO4·7H2O，蒸餾水，pH 7。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、固相微萃取頭（solid phase microextraction，SPME） 美國(guó)Supelo公司；DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；25×16型血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以無(wú)水乙醇為溶劑，分別配制200、400、600、800、1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)圓柚酮溶液，采用SPME-GC-MS檢測(cè)分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、圓柚酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=380 602X+240 216，R2=0.992 6。

1.3.2 菌種活化

凍干菌種管冷藏保存在5～10 ℃。用無(wú)菌吸管吸取0.3～0.4 mL生理鹽水，滴入管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體。取約0.2 mL菌懸液，轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基平板上，在每個(gè)平板的底部做好標(biāo)記，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)長(zhǎng)出細(xì)菌單菌落。將平板用封口膜封好置于4 ℃冰箱中備用。

將A. niger、Mucorsp.接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，Y. lipolytica接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～7 d，待孢子長(zhǎng)出后置于4 ℃冷藏保存。每個(gè)月用斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接活化1 次。

1.3.3 孢子懸浮液制備與底物預(yù)處理

從傳代的菌種培養(yǎng)基中挑取部分菌絲接種于滅菌的斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。以適量無(wú)菌水從生長(zhǎng)良好的斜面培養(yǎng)基上洗下孢子，在搖床上30 ℃、200 r/min振蕩4 h，打散孢子。然后以體積分?jǐn)?shù)0.01%吐溫80為接種劑調(diào)整孢子懸浮液濃度為106～107個(gè)/mL[14,23]。

底物瓦倫西亞橘烯用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存。

1.3.4 菌體預(yù)培養(yǎng)與底物的轉(zhuǎn)化

1.3.4.1A. niger孢子懸浮液轉(zhuǎn)化

取1 000 μL的A. niger孢子懸浮液接種于裝有50 mL蛋白胨培養(yǎng)基（pH 7.0）搖瓶中。30 ℃、100 r/min培養(yǎng)3 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），接著培養(yǎng)4 d。

1.3.4.2Mucorsp.孢子懸浮液轉(zhuǎn)化

取1 000 μL的Mucorsp.孢子懸浮液接種于裝有50 mL蛋白胨培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃、100 r/min培養(yǎng)7 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），30 ℃進(jìn)一步培養(yǎng)4 d。

1.3.4.3Y. lipolytica孢子懸浮液轉(zhuǎn)化

取1 000 μL的Y. lipolytica菌種懸浮液接種于裝有50 mL的YPD培養(yǎng)基搖瓶中，30 ℃、100 r/min培養(yǎng)3 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d。然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。所有實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置底物空白對(duì)照（只添加底物，不添加菌種）和菌株空白對(duì)照（只添加菌種，不添加底物），重復(fù)3 次。

1.3.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

準(zhǔn)確量取5 mL離心后的發(fā)酵液移入20 mL鉗口樣品瓶中，加入1.8 g NaCl以促進(jìn)揮發(fā)性成分的揮發(fā)，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上40 ℃加熱平衡15 min后，通過(guò)隔墊插入己活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（270 ℃活化1 h），推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min，分別測(cè)定黑曲霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯在24、48、72 h和96 h時(shí)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

GC條件：6890N型氣相色譜儀，毛細(xì)管柱為HP-5（30 m×250 μm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃ /min升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS條件：5975B質(zhì)譜儀，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍為45～550 u[24]。

定性分析：采用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，并利用C6～C30正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算各個(gè)色譜峰的保留指數(shù)。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜（NIST05/WILEY7.0）進(jìn)行初步檢索和資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)組成。

定量分析：采用外標(biāo)法進(jìn)行定量圓柚酮。其他產(chǎn)物定量使用環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)，以環(huán)己酮的峰面積與香氣物質(zhì)的峰面積進(jìn)行對(duì)比計(jì)算，以此定量。成分含量及轉(zhuǎn)化率的計(jì)算見(jiàn)下式：

1.3.6 解脂耶氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

1.3.6.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

以YPD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，并分別以30 g/L質(zhì)量濃度的葡萄糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、β-環(huán)糊精和α-乳糖作為唯一碳源，考察碳源種類(lèi)對(duì)產(chǎn)物圓柚酮轉(zhuǎn)化率的影響。

以YPD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以20 g/L酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4和NH4Cl作為單一氮源，考察氮源種類(lèi)對(duì)產(chǎn)物圓柚酮轉(zhuǎn)化率的影響。

以Y P D培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加0.5 g/L的ZnSO4·7H2O、CaC12、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，考察無(wú)機(jī)鹽對(duì)圓柚酮轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.6.2 培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化

表1 培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9（33）Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in L9 (33) orthogonal array design g/L

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的考察，確定最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，如表1所示。以α-乳糖、蛋白胨和FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為變量、以圓柚酮產(chǎn)量為指標(biāo)優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

由3 次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到的各實(shí)驗(yàn)平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行計(jì)算。不同組別間的顯著性采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行F值檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物分析

表2 黑曲霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物Table 2 Conversion products of valencene by A. niger mg/L

柑橘的香氣物質(zhì)主要由單萜類(lèi)和單萜醇組成，而酚類(lèi)化合物、去甲異戊二烯類(lèi)化合物和其他揮發(fā)物對(duì)柑橘香氣也起著重要的作用[25]。如表2所示，黑曲霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、胡椒酮、水芹醛、β-欖香烯、α-紫羅蘭酮、α-香附酮9 種物質(zhì)。在最初的24 h，產(chǎn)物有D-檸檬烯、香芹醇、香芹酮、水芹醛、其中D-檸檬烯質(zhì)量濃度最高，為（14.74±2.55）mg/L。在接下來(lái)的48 h，產(chǎn)物香芹酮和水芹醛含量繼續(xù)增加，而D-檸檬烯、香芹醇含量減少，同時(shí)還有5 種新的物質(zhì)被檢出，包括α-松油醇、胡椒酮、β-欖香烯、α-紫羅蘭酮、α-香附酮；當(dāng)轉(zhuǎn)化72 h時(shí)，檢測(cè)不出香芹醇、α-紫羅蘭酮和α-香附酮。α-香附酮為圓柚酮的同分異構(gòu)體，其在96 h也被檢出。最近研究發(fā)現(xiàn)，葡萄基因組中含有一大類(lèi)單萜烯合成酶和倍半萜合成酶，其中許多已被確定能夠生產(chǎn)芳香單萜醇，如香葉醇、芳樟醇和α-松油醇等[26-27]。轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物中，檸檬烯是除圓柚酮外產(chǎn)量最高的產(chǎn)物，據(jù)文獻(xiàn)[28]報(bào)道，檸檬烯在進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化時(shí)，主要發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)以及水解反應(yīng)，其氧化可產(chǎn)生l、2位環(huán)氧化物質(zhì)，在發(fā)生水解反應(yīng)時(shí)，主要水解產(chǎn)物為檸檬烯-1,2-二醇；在6位發(fā)生羥基化反應(yīng)以及羰基化反應(yīng)時(shí)，其產(chǎn)物主要為香芹酮以及二氫香芹酮；在8位發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)物為松油醇。瓦倫西亞橘烯微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，α-松油醇、香芹酮等可能為檸檬烯的代謝產(chǎn)物。

圖2 黑曲霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉(zhuǎn)化量以及轉(zhuǎn)化率Fig. 2 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by A. niger

如圖2所示，在24 h內(nèi)，圓柚酮有少量生成，轉(zhuǎn)化量達(dá)到（4.66±2.75）mg/L；在24～48 h，圓柚酮大量生成，其質(zhì)量濃度達(dá)到（140.94±30.26）mg/L；當(dāng)轉(zhuǎn)化至72 h，圓柚酮產(chǎn)量開(kāi)始降低，可能是由于產(chǎn)物不斷生成積累使得轉(zhuǎn)化量降低，轉(zhuǎn)化圓柚酮受到抑制；當(dāng)轉(zhuǎn)化至96 h，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量持續(xù)降低，轉(zhuǎn)化量為（91.97±9.80）mg/L。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，圓柚酮的轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到（15.32±3.29）%。曲霉的生物活性很高，有關(guān)曲霉生物轉(zhuǎn)化萜類(lèi)物質(zhì)的研究，也有一些報(bào)道。Furusawa等[18]發(fā)現(xiàn)黑曲霉（Aspergillus niger）轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯5 d后，并未發(fā)現(xiàn)生成圓柚酮。Rocha等[29]研究發(fā)現(xiàn)土壤曲霉（Aspergillus terreus）可以對(duì)倍半萜內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生一種罕見(jiàn)的衍生物，表明土壤真菌可能在倍半萜內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化。

2.2 毛霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物分析

表3 毛霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物Table 3 Conversion products of valencene by Mucor sp.mg/L

毛霉能對(duì)許多自然物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[30]。如表3所示，毛霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、水芹醛、紫蘇醇、肉豆蔻醛和α-香附酮8 種物質(zhì)，這與黑曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有所相同。在最初的24 h，瓦倫西亞橘烯被轉(zhuǎn)化為右旋萜二烯（D-檸檬烯），其質(zhì)量濃度為（15.61±4.34）mg/L。在2 4～4 8 h，D-檸檬烯含量開(kāi)始降低，質(zhì)量濃度為（1.6 2±0.3 7）m g/L，同時(shí)新生成5 種產(chǎn)物，包括α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇、α-香附酮；當(dāng)轉(zhuǎn)化至72 h，α-香附酮含量持續(xù)增加，D-檸檬烯含量保持穩(wěn)定，另外，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇含量降低，同時(shí)得到一種新的產(chǎn)物肉豆蔻醛（（5.52±2.69）mg/L）；在轉(zhuǎn)化至96 h，各種物質(zhì)的含量趨于穩(wěn)定，檢出新的物質(zhì)水芹醛（（7.09±2.59）mg/L），未檢測(cè)到肉豆蔻醛。檸檬烯是除圓柚酮外產(chǎn)量最高的產(chǎn)物，檸檬烯在7位發(fā)生甲基的羥基化反應(yīng)時(shí)，可以得到產(chǎn)物紫蘇醇。瓦倫西亞橘烯微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇等可能為檸檬烯的代謝產(chǎn)物。

圖3 毛霉轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉(zhuǎn)化量以及轉(zhuǎn)化率Fig. 3 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by Mucor sp.

如圖3所示，在初始24 h，圓柚酮有少量生成，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量達(dá)到（3.16±4.31）mg/L；在48～72 h，圓柚酮大量生成，其質(zhì)量濃度達(dá)到（112.73±23.04）mg/L；當(dāng)轉(zhuǎn)化至72 h，圓柚酮轉(zhuǎn)化量持續(xù)增加，底物瓦倫西亞橘烯繼續(xù)轉(zhuǎn)化，圓柚酮轉(zhuǎn)化量達(dá)到（137.67±14.02）mg/L；當(dāng)轉(zhuǎn)化至96 h，產(chǎn)物含量基本保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化量為（142.18±30.90）mg/L。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，圓柚酮的轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到（15.45±3.36）%，其轉(zhuǎn)化能力和黑曲霉差不多。毛霉能夠選擇性地將瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為圓柚酮，F(xiàn)urusawa等[31]發(fā)現(xiàn)從苔類(lèi)植物黏附的土壤中分離出的一株菌種，經(jīng)鑒定為毛霉，其轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成4 種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中圓柚酮的轉(zhuǎn)化率達(dá)82%，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化率要低于其轉(zhuǎn)化率，可能是由于其所用菌株為自然分離，雖然和Mucorsp.同屬一個(gè)種，但生物轉(zhuǎn)化能力不同。

2.3 解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物分析

如表4所示，解脂耶氏酵母對(duì)瓦倫西亞橘烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇、甲基丁香酚、石竹烯和α-香附酮8 種物質(zhì)。在最初的24 h，檢出的產(chǎn)物為D-檸檬烯、α-松油醇、香芹酮、甲基丁香酚、石竹烯和α-香附酮，其中石竹烯質(zhì)量濃度最高，達(dá)到（8.29±1.17）mg/L。在48～72 h，這6 種產(chǎn)物繼續(xù)積累，同時(shí)生成2 種新的物質(zhì)，包括香芹醇（（13.53±1.71）mg/L）和紫蘇醇（（1.15±0.13）mg/L）；當(dāng)轉(zhuǎn)化至72 h，所有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量都有所降低，同時(shí)并未檢測(cè)到紫蘇醇，香芹酮質(zhì)量濃度最低（（0.22±0.12）mg/L）；轉(zhuǎn)化至96 h，D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇和石竹烯含量繼續(xù)降低，α-香附酮質(zhì)量濃度有所增加（（8.63±1.02） mg/L），未檢測(cè)到香芹酮，紫蘇醇和甲基丁香酚。瓦倫西亞橘烯微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，檸檬烯在48 h產(chǎn)量很高，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇等可能為檸檬烯的代謝產(chǎn)物。

表4 解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物Table 4 Conversion products of valencene by Y. lipolytica mg/L

圖4 解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉(zhuǎn)化量以及轉(zhuǎn)化率Fig. 4 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by Y. lipolytica

如圖4所示，在初始24 h，圓柚酮有大量生成，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量達(dá)到（155.75±12.64）mg/L；在48～72 h，圓柚酮持續(xù)生成，其轉(zhuǎn)化量達(dá)到（252.52±15.79）mg/L；當(dāng)轉(zhuǎn)化至72 h，圓柚酮含量保持穩(wěn)定，但有所降低；當(dāng)轉(zhuǎn)化至96 h，產(chǎn)物含量基本保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化量為（249.62±17.23）mg/L。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，圓柚酮轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到（27.45±1.72）%，其轉(zhuǎn)化能力與黑曲霉和毛霉相比，轉(zhuǎn)化率更高。Palmerín-Carre等[22]利用Y. lipolytica2.2ab菌株，進(jìn)行圓柚酮轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)加入3.2 g/L底物，在雙相系統(tǒng)條件下對(duì)瓦倫西亞橘烯進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最終得到圓柚酮轉(zhuǎn)化量為216.9 mg/L，在單一有機(jī)相的條件下對(duì)瓦倫西亞橘烯進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化量達(dá)217.4 mg/L。與本實(shí)驗(yàn)相比，加入0.92 g/L的底物，通過(guò)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的含量略高于其研究，主要原因可能是降低底物質(zhì)量濃度，減少了底物的抑制作用。在Wriessnegger等[32]的研究中，畢赤酵母（Pichia pastoris）被用作全細(xì)胞生物催化劑，從橙子的豐富香氣化合物瓦倫西亞橘烯中生產(chǎn)圓柚酮，并發(fā)現(xiàn)畢赤酵母醇脫氫酶和截短的羥基-甲基戊二酰輔酶A還原酶顯著增強(qiáng)圓柚酮的產(chǎn)量（208 mg/L）。利用酶進(jìn)行合成轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯也有相應(yīng)的研究。另外，阿拉斯加雪松酵母中瓦倫西亞橘烯合成酶和瓦倫西亞橘烯氧化酶可以共表達(dá)轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮（144 μg/L），在不采用雙相介質(zhì)（正十二烷為有機(jī)相）的條件下，僅生成3 μg/L的圓柚酮[33]，其轉(zhuǎn)化量遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)。在單一水相的條件下，菌種Phanerochaete chrysosporium轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮產(chǎn)量達(dá)110.3 mg/L，在雙相體系條件下，單胞菌Botryodiplodia theobromae轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮產(chǎn)量達(dá)239.7 mg/L[22]，而本研究發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化能力要高于這兩株菌。Gavira等[34]利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），采用一種基因挖掘的方法，從高等植物中篩選出4 種潛在的P450酶，并在重組酵母微粒體中篩選相應(yīng)的酶，生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生β-圓柚酮和圓柚酮，同時(shí)，其隨著底物質(zhì)量濃度的增加而降低，本實(shí)驗(yàn)也得到相同的結(jié)果。

2.4 解脂耶氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化能力要明顯高于黑曲霉和毛霉，故選取解脂耶氏酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化。

2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

由圖5A可知，選取的7 種碳源均可以促進(jìn)菌種生長(zhǎng)，但其轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量不同。其中α-乳糖最有利于瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮，因?yàn)槿樘鞘潜容^易被微生物利用的糖，是促進(jìn)細(xì)胞快速生長(zhǎng)的一種有效的糖類(lèi)物質(zhì)。α-乳糖作為碳源進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)化時(shí)，其轉(zhuǎn)化圓柚酮產(chǎn)量達(dá)到228.16 mg/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到24.80%。相較于其他幾種碳源，其轉(zhuǎn)化效率更高，其中蔗糖的轉(zhuǎn)化效果與α-乳糖相差無(wú)幾，其轉(zhuǎn)化圓柚酮質(zhì)量濃度達(dá)到207.47 mg/L，轉(zhuǎn)化率為22.55%。糊精相較于其他6 種碳源，其轉(zhuǎn)化效率最低，轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的量?jī)H為8.98 mg/L，其轉(zhuǎn)化率也僅為0.98%。

由圖5B可知，在實(shí)驗(yàn)選取的5 種氮源進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，蛋白胨最有利于瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮。其在同等質(zhì)量濃度的氮源條件下，其轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的量最高，其轉(zhuǎn)化生成圓柚酮質(zhì)量濃度達(dá)到367.09 mg/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到39.90%。在利用蛋白胨為唯一氮源的條件下，其轉(zhuǎn)化的能力要明顯高于其他4 種氮源，其中包括2 種無(wú)機(jī)氮源。

無(wú)機(jī)鹽離子大部分作為酶的輔基和激活劑，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子的穩(wěn)定性，通過(guò)控制細(xì)胞的氧化還原電位，調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞的滲透壓平衡，并作為能量來(lái)源。通常在低濃度條件下，無(wú)機(jī)鹽能夠促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，而在高濃度時(shí)常表現(xiàn)出明顯的抑制作用[35]。P、S、K、Mg等元素可以參與細(xì)胞的組成，并具有能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞透性調(diào)節(jié)等功能。如圖5C所示，在培養(yǎng)基中添加少量的Fe2+、Cu2+后對(duì)于轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用，可能是因?yàn)镕e2+、Cu2+是P450酶系需要的離子，P450酶能將Fe2+氧化得到電子[36]。由于Fe2+明顯的促進(jìn)作用，其轉(zhuǎn)化圓柚酮的量達(dá)到（435.95±24.40）mg/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到（47.38±2.65）%，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取其作為金屬鹽進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。

圖5 碳源（A）、氮源（B）以及無(wú)機(jī)鹽（C）對(duì)圓柚酮轉(zhuǎn)化量以及轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources (A), nitrogen sources (B) and metal ions (C) on conversion rate of nootkatone

2.4.2 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，從轉(zhuǎn)化結(jié)果以及轉(zhuǎn)化率來(lái)看，F(xiàn)eSO4·7H2O、α-乳糖和蛋白胨3 個(gè)因素對(duì)瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮轉(zhuǎn)化量的影響順序?yàn)椋篎eSO4·7H2O＞α-乳糖＞蛋白胨。均值K代表同一因素不同水平的重要性，其中K值越高，對(duì)此因素的影響越大[37]。通過(guò)各因素組合，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)7最有利于解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮，其組合為α-乳糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、FeSO4·7H2O 0.6 g/L，圓柚酮轉(zhuǎn)化量達(dá)到（457.32±76.11）mg/L，圓柚酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到49%。利用初始YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量?jī)H為（252.52±15.79）mg/L，轉(zhuǎn)化率為（27.45±1.72）%，優(yōu)化培養(yǎng)基后，發(fā)酵培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化率提高了21.55%。可能是由于初始YPD培養(yǎng)基是適合幾乎所有酵母生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，但是對(duì)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯并不是很適合，通過(guò)正交試驗(yàn)，可以得到其最適合轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基成分。

表5 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用SPME-GC-MS分析3 株真菌轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，共檢出14 種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中，D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮和

α-香附酮在3 種菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中均被檢出。3 種菌株都可對(duì)瓦倫西亞橘烯進(jìn)行轉(zhuǎn)化并生成圓柚酮，其中解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，在48 h時(shí)生成（252.52±15.79）mg/L圓柚酮，轉(zhuǎn)化率為（27.45±1.72）%，表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)化能力。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，圓柚酮轉(zhuǎn)化量達(dá)到（457.32±76.11）mg/L，圓柚酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到49%，和未優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基相比，轉(zhuǎn)化率提高了21.55%。