彭媛媛，王昱圭，湯雪纖，趙 欣，張甫生，鄭 炯,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心（西南大學(xué)），重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067）

食品體系的功能特性由多糖、蛋白質(zhì)、脂類及其他生物大分子共同決定[1]。由于多糖在一定程度上能修飾蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，改善單一蛋白質(zhì)在等電點附近失穩(wěn)聚沉現(xiàn)象，故多糖和蛋白質(zhì)在很大程度上影響著食品體系的微觀結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和質(zhì)地[2]。近年來，多糖和蛋白質(zhì)的相互作用已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如新型凝膠[3]、乳液穩(wěn)定[4]和微膠囊[5-6]等。但蛋白質(zhì)和多糖間的作用主要由靜電力驅(qū)動，故pH值會影響其相互作用，大多數(shù)多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系對pH值環(huán)境條件變化表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性[7]。因此，研究多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系在不同pH值下發(fā)生的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化對其在不同pH值食品體系中的應(yīng)用具有重要意義。

Yuan Yang等[8]發(fā)現(xiàn)，在pH 5.5和pH 6.0時殼聚糖和大豆球蛋白復(fù)合體系均能形成微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但體系只在pH 5.0時具有較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。牛付閣等[9]發(fā)現(xiàn)隨著pH值的變化阿拉伯膠/卵白蛋白復(fù)合溶液呈現(xiàn)出4 個不同的相區(qū)（共溶區(qū)、可溶性復(fù)合物相區(qū)、不溶性復(fù)合物相區(qū)、共溶區(qū)）。Turgeon等[10]也發(fā)現(xiàn)，不同pH值條件下黃原膠和β-乳球蛋白相互作用是不同的，隨著pH值降低到β-乳球蛋白等電點以下，體系由溶膠轉(zhuǎn)化為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，故在不同pH值下復(fù)合體系結(jié)構(gòu)是有差異的。李成倍[11]發(fā)現(xiàn)在pH 4.0～4.2時高酰基結(jié)冷膠與酪蛋白酸鈉通過絡(luò)合作用逐漸形成共聚體，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)。酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，SC）是由酪蛋白堿處理得到的一類可溶性蛋白質(zhì)[12]，常作為增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[13-14]。但SC在酸性條件下失穩(wěn)聚沉的現(xiàn)象制約其應(yīng)用。水解桃膠[15]、羧甲基纖維素[16]、海藻酸鈉[17]等高分子質(zhì)量水溶性多糖的添加，可對SC進(jìn)行改性修飾，并改善其功能特性，使其具有更廣泛的應(yīng)用前景。低酯果膠（low methoxyl pectin，LMP）作為一種水溶性多糖，具有良好的食用功效，且在較廣的pH值范圍（pH 2.0～6.0）內(nèi)具有較好的凝膠性能[18]。在酸性條件下，帶有較多負(fù)電荷的LMP，可以吸附在蛋白質(zhì)表面，并能通過靜電作用和空間位阻作用穩(wěn)定體系[19-20]。因此向SC溶液體系中加入適量LMP，能提高體系在酸性條件下的穩(wěn)定性。

目前關(guān)于pH值影響多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系結(jié)構(gòu)性質(zhì)的報道較多，但針對LMP/SC復(fù)合體系在不同pH值下流變及結(jié)構(gòu)特性的系統(tǒng)研究較少。因此，本實驗以LMP/SC復(fù)合體系為研究對象，在不同酸性條件下（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）研究其流變特性、Zeta電位、粒徑、濁度及微觀結(jié)構(gòu)的變化，明確相關(guān)特性與pH值環(huán)境條件的關(guān)系，以期為不同酸性條件下LMP/SC復(fù)合體系在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LMP（食品級，酯化度20%） 河南恒銳食品生物科技有限公司；SC（食品級，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）上海極威生物科技有限公司；檸檬酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A電子分析天平 上海精天電子儀器有限公司；pHS-3C酸度計 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA公司；2100AN濁度儀美國Hach公司；Nano-ZS & MPT-2 Zeta電位及納米粒度儀英國Malvern公司；JSM-6510LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

參考牛付閣[9]和邱蓉[21]等的方法稍有改動，在100 mL蒸餾水加入1 g SC和0.5 g LMP，80 ℃加熱60 min，加熱過程不斷攪拌，使體系充分水化溶解后靜置冷卻。用不同質(zhì)量濃度檸檬酸（5、12.5、25、50 g/100 mL）調(diào)節(jié)體系pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，確保檸檬酸對溶液的稀釋作用最小。然后在4 ℃冰箱靜置24 h后進(jìn)行測定。

1.3.2 流變特性的測定

樣品處理：參考劉麗婭[22]的方法稍做改動。采用平板-平板測量系統(tǒng)，平板直徑40 mm，設(shè)置間隙1.0 mm，取適量樣品于平行板，除去多余樣品，并用硅油密封表面以防止水分蒸發(fā)。每個樣品測試前保留時間180 s，測量溫度25 ℃。

靜態(tài)流變學(xué)測定：設(shè)置剪切速率從0.1～300 s-1遞增后，再從300～0.1 s-1遞減，測定過程中剪切應(yīng)力及黏度的變化情況。采用Herschel-Bulkey模型（下式）對所得數(shù)據(jù)點進(jìn)行回歸擬合，擬合系數(shù)R2表示方程擬合精度。

式中：σ為剪切應(yīng)力/Pa；K為稠度系數(shù)/（Pa·sn）；γ為剪切速率/s-1；n為流體指數(shù)；σ0為屈服應(yīng)力/Pa。

動態(tài)黏彈性測定：控制掃描應(yīng)變值0.5%，確保測定過程在樣品線性黏彈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，振蕩頻率0.1～10 Hz，測定不同樣品儲能模量（G′）、損耗模量（G”）以及損耗正切角（tanδ）隨角頻率的變化情況。

1.3.3 粒徑的測定

將待測樣品用蒸餾水稀釋1 000 倍后，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)體系pH值與稀釋前一致。采用納米粒度儀測定其粒徑大小。平衡時間2 min，測定溫度25 ℃，所用光源為最大輸出功率10 W的He-Ne激光，檢測角90°，檢測波長633 nm。避免多重光散射，每次循環(huán)掃描10～120 次，每個樣品重復(fù)測量3 次。

1.3.4 Zeta電位的測定

將待測樣品用蒸餾水稀釋1 000 倍后，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)體系pH值與稀釋前一致。采用納米粒度儀測定不同條件下LMP/SC復(fù)合體系的Zeta電位。測定條件：折疊毛細(xì)管樣品池，0.45 cm2鉑電極，折疊毛細(xì)管間距0.4 cm。平衡時間2 min，測定溫度25 ℃。每次循環(huán)掃描10～100 次，每個樣品重復(fù)測量3 次。

1.3.5 濁度的測定

采用濁度儀測定：開機(jī)預(yù)熱30 min之后對儀器進(jìn)行標(biāo)定校準(zhǔn)，緩慢注入50 mL待測液于樣杯中，蓋上樣杯蓋，用濾紙擦凈杯體后將其平穩(wěn)置入比色池，關(guān)閉池蓋。待顯示數(shù)據(jù)穩(wěn)定，讀出樣品濁度值，每個樣品重復(fù)測量3 次。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)的測定

將制備好的樣品倒入培養(yǎng)皿中，使樣品均勻平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)，放入冰箱凍藏24 h，使樣品完全結(jié)冰。再放入真空冷凍干燥機(jī)中，于-50 ℃進(jìn)行抽真空冷凍干燥72 h，使得樣品完全干燥。將干燥后的樣品固定在雙面導(dǎo)電樣品臺上，利用離子濺射儀使樣品具有導(dǎo)電性。使用掃描電子顯微鏡在500放大倍率下，對樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并選擇具有代表性的視野進(jìn)行記錄拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)使用Origin 8.0和Microsoft Excel繪制相關(guān)圖表。粒徑、Zeta電位、濁度數(shù)據(jù)使用SPSS 20對其進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析（P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著）。每次測試前需更換樣品，且每組實驗均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對復(fù)合體系流變學(xué)特性的影響

2.1.1 靜態(tài)剪切流變學(xué)特性

由圖1可知，復(fù)合體系剪切應(yīng)力隨剪切速率的增大而增大，最后趨于平緩，呈現(xiàn)出剪切稀化的流體特征。在低剪切速率時，由于單位體積中大分子纏繞碰撞幾率比外力引起的纏結(jié)斷裂的幾率大，體系黏度此時較大；隨著剪切速率的增大，分子交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，體系黏度也隨之減小[23]。在pH 3.0～4.0時，體系剪切應(yīng)力隨pH值的增大而減??；在pH 4.0～4.5時，體系剪切應(yīng)力出現(xiàn)驟增；在pH 4.5～5.5時，體系剪切應(yīng)力又隨pH值的增大而減小，且在pH 5.5時最小。

圖1 不同pH值下LMP/SC復(fù)合體系剪切應(yīng)力隨剪切速率變化曲線Fig. 1 Shear stress vs. shear rate curves of LMP/SC composite system at different pH values

由表1可知，擬合曲線決定系數(shù)R2均大于0.99，故模型精度較高。流體指數(shù)n代表流體假塑性程度，n值偏離1的程度越大，表明體系越容易剪切變稀，即假塑性程度越大[24]。結(jié)果表明，n值均小于1，屈服應(yīng)力σ0大于0，表明在剪切速率范圍內(nèi)，體系呈現(xiàn)出有屈服值的剪切變稀非牛頓流體特性[25]。稠度系數(shù)K反映體系黏稠程度，結(jié)果表明：在pH 3.0～4.0時，隨著pH值的增大，K值減小，n值增大，體系表觀黏度減??；在pH 4.0～4.5時，K值和σ0值出現(xiàn)驟升，n值出現(xiàn)驟降，體系表觀黏度驟增，剪切變稀現(xiàn)象進(jìn)一步增強(qiáng)，假塑性流體行為也更加明顯[26]；在pH 4.5～5.5時，隨著pH值的增大，K值下降，n值增大，復(fù)合體系表觀黏度進(jìn)一步減小。總體上，隨著pH值的增大，復(fù)合體系表觀黏度呈現(xiàn)出先減小，在SC等電點附近驟增，然后繼續(xù)減小的趨勢。

表1 LMP/SC復(fù)合體系Herschel-Bulkey方程擬合參數(shù)Table 1 Herschel-Bulkey equation fi tting parameters for LMP/SC composite system

2.1.2 動態(tài)黏彈流變學(xué)特性

tanδ反映G”與G′的比值，G′代表儲存在復(fù)合體系中的能量，反映體系彈性大小，G”代表體系由于不可逆黏性形變損耗的能量大小，反映體系黏性大小[24]。故tanδ反映體系黏性和彈性對LMP/SC復(fù)合體系黏彈性質(zhì)的相對貢獻(xiàn)，tanδ小說明體系處于類似固體的狀態(tài)，流動性相對差，tanδ大則表明體系呈現(xiàn)類似液體的狀態(tài)，流動性較大，而復(fù)合體系大部分tanδ大于1，說明體系顯現(xiàn)出黏性為主的液體特性[27]。由圖2a可知，隨pH值的增大，體系tanδ呈現(xiàn)出兩段變化：在pH 3.0～4.0時，tanδ隨著pH值的增大而增大，復(fù)合體系流動性增強(qiáng)；在pH 4.5～5.5時，tanδ驟減后隨pH值的增大進(jìn)一步增大。由圖2b可知，體系的G”也呈現(xiàn)兩段變化：在pH 3.0～4.0時，G”隨pH值的增大而減??；在pH 4.5時，G”出現(xiàn)驟增，此時體系黏性最大；在pH 4.5～5.5時，隨著pH值的增大，G”減小幅度更大，體系黏性減小更多。復(fù)合體系黏性在SC等電點（pH 4.5）附近會發(fā)生突變，且在pH值高于SC等電點后，pH值變化對體系流體特性的影響更大。

圖2 LMP/SC復(fù)合體系tanδ（a）和G”（b）隨頻率變化曲線Fig. 2 tanδ (a) and loss modulus (b) vs. frequency curves of LMP/SC composite system

2.2 pH值對復(fù)合體系Zeta電位及粒徑的影響

Zeta電位代表體系內(nèi)微粒的平均電位，可衡量多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合物表面的電荷密度變化[28]，粒徑代表體系內(nèi)微粒大小，兩者均能反映體系的穩(wěn)定性。在不同pH值條件下，體系Zeta電位和平均粒徑均存在顯著性差異（P＜0.05）。由圖3A、B可知，隨著pH值的增大，復(fù)合體系粒徑先增大后減小，且在pH 4.5時最大；復(fù)合體系Zeta電位隨著pH值的增大而減小，當(dāng)pH 4.5～5.5時，Zeta電位由正值減小為負(fù)值。而Zeta電位絕對值先減小后增大，表明復(fù)合體系穩(wěn)定性先減小后增大。LMP/SC復(fù)合體系在SC等電點（pH 4.5）附近結(jié)構(gòu)特性發(fā)生突變，這與流變學(xué)特性的測定結(jié)果相一致。

圖3 不同pH值下復(fù)合體系Zeta電位（A）及粒徑（B）的變化Fig. 3 Changes in zeta potential (A) and particle size (B) at different pH values

2.3 pH值對復(fù)合體系濁度的影響

圖4 不同pH值下復(fù)合體系的濁度（A）和樣品圖（B）Fig. 4 Turbidity (A) and visual appearance (B) of composite system at different pH values

濁度表征光散射對入射光的衰減，反映溶液對光線通過時所產(chǎn)生的阻礙程度，濁度與體系中懸浮物質(zhì)含量及其大小形狀等有關(guān)。Rayleigh散射理論表明溶液體系內(nèi)顆粒直徑的增加通常會導(dǎo)致體系濁度的增加[21]。由圖4A可知，在不同pH值條件下，體系濁度差異顯著（P＜0.05）。隨著體系pH值的增大，濁度值呈先增大后減小的趨勢，表明pH值能在一定程度上改變復(fù)合體系的顆粒大小和形狀。濁度值在pH 4.5時最大，表明此時LMP/SC復(fù)合體系對光線通過的阻礙最大，這與Zeta電位及粒徑的測定結(jié)果一致。由圖4B可知，隨著pH值的減小，LMP/SC復(fù)合體系顏色先略微變深，后逐漸變淺，由最初的乳白色共溶體系變?yōu)闇\白色的半透明水凝膠狀態(tài)。

2.4 pH值對復(fù)合體系微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖5 LMP/SC復(fù)合體系的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM photographs of LMP/SC composite system

由圖5A、B可知，在pH 5.5時體系結(jié)構(gòu)比較雜亂，松散的片狀結(jié)構(gòu)呈堆砌狀態(tài)。但隨著pH值的減小，體系內(nèi)片狀結(jié)構(gòu)趨于規(guī)則；在pH 5.0時，復(fù)合體系中光滑的片狀LMP貼附在SC表面，同時條狀LMP向外延伸連結(jié)體系其他部分，說明pH值在高于SC等電點的酸性條件下，仍存在部分果膠吸附在酪蛋白膠束表面，形成微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29]。

由圖5C、D可知，LMP/SC復(fù)合體系微觀結(jié)構(gòu)隨pH值的降低發(fā)生明顯變化，體系變得更為立體致密。pH值在SC等電點附近時，體系內(nèi)LMP分子鏈伸展連結(jié)球狀SC顆粒，形成連續(xù)性更佳的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。表明LMP能改善SC在等電點附近失穩(wěn)聚沉的現(xiàn)象，提高酸性條件下SC的穩(wěn)定性。這與陰離子多糖黃原膠在酸乳中能通過靜電作用和空間位阻作用改善酪蛋白簇的原有結(jié)構(gòu)相類似[30]。

由圖5E、F可知，當(dāng)pH值降低到SC等電點以下后，LMP/SC復(fù)合體系結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)生改變，陰離子多糖LMP開始填充在SC的空隙中，形成一種“嵌入”式結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)整體空隙數(shù)目減少，體系內(nèi)的分支更細(xì)薄，且呈現(xiàn)出片狀、條狀結(jié)構(gòu)的纏繞鉤掛。此時體系開始表現(xiàn)出以LMP為主體的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)pH 3.0時，這種結(jié)構(gòu)最為明顯，光滑而纖細(xì)的鏈狀LMP結(jié)構(gòu)像觸頭一樣伸展在體系中。

3 討 論

3.1 pH值對復(fù)合體系流變學(xué)特性的影響

食品結(jié)構(gòu)往往能被外力及形變作用改變，研究流變行為可對食品體系的分子形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)有進(jìn)一步了解。實際上流變特性指體系同時表現(xiàn)出固體的彈性和液體的黏性[11]。LMP/SC復(fù)合體系流變學(xué)測定結(jié)果表明：LMP/SC復(fù)合體系在pH 3.0～5.5時，呈現(xiàn)出剪切變稀的非牛頓流體流動特性。由于LMP/SC復(fù)合體系內(nèi)存在鏈狀分子構(gòu)成的膠體粒子，在低剪切速率時這些鏈狀分子間相互鉤掛纏繞，體系表現(xiàn)出黏度較大的狀態(tài)；在剪切速率較大時鏈狀粒子較為散亂，相互勾掛現(xiàn)象減少，體系出現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象。隨著pH值的減小，體系先呈現(xiàn)出表觀黏度逐漸增大、流動性逐漸變小的現(xiàn)象；而當(dāng)pH值在SC等電點附近，體系表觀黏度出現(xiàn)驟減；而隨著pH值的進(jìn)一步減小，復(fù)合體系表觀黏度繼續(xù)增大、流動性也進(jìn)一步減小。在復(fù)合體系中，隨著pH值的降低，LMP可吸附在SC表面，而SC和LMP結(jié)合程度也影響體系的黏度和流動性。因未吸附在SC表面的LMP能在一定程度上增加體系的黏度，同時這部分LMP能與LMP/SC復(fù)合膠粒之間形成弱網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3.2 pH值對復(fù)合體系結(jié)構(gòu)特征的影響

Zeta電位和粒徑可以反映LMP/SC復(fù)合體系結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，測定結(jié)果表明：隨著pH值減小，LMP/SC復(fù)合體系顆粒先增大后減小，穩(wěn)定性先減小后增大。pH值主要是通過影響氨基、羧基等大分子功能集團(tuán)的離子化程度影響多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系的相互作用[7]，隨著pH值減小，帶負(fù)電的多糖LMP能通過靜電作用逐漸吸附在帶正電的SC顆粒表面，使其粒徑變大。在SC等電點附近形成的LMP/SC復(fù)合物帶有一定數(shù)量的凈負(fù)電荷，膠粒間的靜電排斥作用較大，足以抵抗膠粒間的進(jìn)一步復(fù)合凝聚，改善單一蛋白質(zhì)分子在等電點附近失穩(wěn)聚沉現(xiàn)象，此時Zeta電位值為負(fù)。當(dāng)pH值低于SC等電點時，Zeta電位值變?yōu)檎?。SC所帶正電荷增加，多糖LMP側(cè)鏈上的羧基基團(tuán)被質(zhì)子化而帶有部分凈正電荷，凈負(fù)電荷減少[9]。結(jié)構(gòu)特性表明：當(dāng)pH值高于SC等電點時，SC膠束表面的κ-酪蛋白存在的正電荷區(qū)域也能與陰離子多糖LMP發(fā)生一定程度的靜電絡(luò)合作用[29]。隨著pH值減小，復(fù)合體系由溶膠結(jié)構(gòu)向微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變。在SC等電點（pH 4.5）附近，帶負(fù)電的LMP與帶正電的球狀SC分子通過強(qiáng)靜電作用形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，同時鏈狀LMP分子起到連結(jié)作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著pH值進(jìn)一步減小，當(dāng)pH 3.0～4.0時，體系開始更多呈現(xiàn)多糖LMP為主體的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[10]，這可能是LMP分子鏈間的羧基，通過SC“架橋”實現(xiàn)連接；同時LMP分子間排斥作用非常小，鏈間距離降低，形成氫鍵；而SC的存在使得體系水分活度較低，此時復(fù)合體系能產(chǎn)生足夠的疏水相互作用穩(wěn)定分子的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。故在低pH值體系中，氫鍵及疏水相互作用均有助于LMP凝膠結(jié)構(gòu)的形成。

4 結(jié) 論

pH值對LMP/SC復(fù)合體系具有較大的影響。隨著pH值減小，復(fù)合體系能從共溶階段過渡到凝膠階段。在pH值高于SC等電點時，已存在少量LMP吸附在酪蛋白膠束帶正電的基團(tuán)上，形成微凝膠結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，隨著pH值的降低，體系表觀黏度增大，流動性減弱；當(dāng)pH值減小到其等電點附近時，LMP/SC復(fù)合體系由靜電相互作用形成較為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；隨著pH值繼續(xù)減小，體系形成以LMP為主體的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果不僅為LMP/SC復(fù)合體系在乳制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，還能拓寬其在食品行業(yè)中的應(yīng)用范圍。