舒暢，夏潔，袁帥，趙帥，張西鋒，鄢又玉

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

茯苓（Poria cocos）是一種東方真菌，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)因其利尿，鎮(zhèn)靜和滋補(bǔ)作用而被廣泛用作中草藥[1]。相關(guān)研究表明，多糖為茯苓中所含主要功效成分之一[2]。真菌多糖是一種代謝產(chǎn)物，由十多種單糖組成，通過(guò)糖苷鍵連接形成天然聚合物[3]。它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、控制細(xì)胞分化、抗腫瘤炎癥、提高機(jī)體抵抗力等多種生物活性[4-5]。茯苓多糖還具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用[6-8]。干茯苓中含有80%以上堿溶多糖，該多糖是一種線性β（1→3）糖苷鍵連接的葡聚糖，由于含有較長(zhǎng)的β（1→6）糖苷鍵連接的支鏈，該多糖不溶于水且基本上沒(méi)有抗癌活性[9-10]。但是，經(jīng)化學(xué)改性后得到可溶于水的羧甲基化茯苓多糖，其抗癌抗腫瘤等生物活性顯著提高[11]?？紤]到茯苓中主要成分為不溶于水的堿溶性多糖，而羧甲基茯苓多糖溶于水利于應(yīng)用，且其合成工藝較成熟，合成成本低，故試驗(yàn)選擇羧甲基茯苓多糖為研究對(duì)象。

鐵是人體必需的微量元素之一，臨床上常以FeSO4的形式給機(jī)體補(bǔ)充鐵。但Fe2+易產(chǎn)生內(nèi)源性自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷細(xì)胞膜，故不宜長(zhǎng)期使用[12]。為了盡可能避免這些副作用，第三代補(bǔ)鐵劑，即以多糖等生物大分子與Fe3+形成的復(fù)合物應(yīng)運(yùn)而生。其中Fe3+通過(guò)氧橋或羥基橋與多糖結(jié)合，形成穩(wěn)定的多糖鐵復(fù)合物[13]，它具有副作用小、穩(wěn)定性及溶解性好等優(yōu)良特性[14]，在進(jìn)入人體后，一般是以分子形式被機(jī)體吸收利用，F(xiàn)e3+在人體環(huán)境下慢慢溶出，被抗壞血酸還原為Fe2+被人體吸收利用[15]。相對(duì)于FeSO4而言對(duì)胃腸道刺激及損傷大大降低，并且在釋放鐵之后，多糖又具備多重生物活性供機(jī)體吸收利用，作為補(bǔ)鐵劑具有雙效作用[16]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種找到最佳加工參數(shù)的有效統(tǒng)計(jì)技術(shù)，它已被用于優(yōu)化多糖鐵的合成工藝變量以及這些變量之間的相互作用[17-18]。本研究以Box-Behnken 設(shè)計(jì)（boxbehnken design，BBD)來(lái)優(yōu)化CMPIC 的合成條件。

眾所周知，疾病或某些外源性藥物或毒物入侵會(huì)導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)紊亂，氧自由基代謝失去平衡，最終可能導(dǎo)致包括DNA、蛋白質(zhì)等多種生物物質(zhì)破壞[19-20]，帶來(lái)各種疾病和病癥，如癌癥、心血管疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化等[21]。近年來(lái)，由于合成抗氧化劑的致癌性，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注尋找天然、有效和低細(xì)胞毒性的抗氧化劑[22]。據(jù)報(bào)道，從植物中分離的多糖對(duì)自由基具有一定的強(qiáng)抗氧化能力，因此有必要更加關(guān)注探索它們作為新型潛在抗氧化劑的應(yīng)用[23-24]。本研究的目的是優(yōu)化羧甲基茯苓多糖鐵復(fù)合物(carboxymethyl pachymaran-Iron（Ⅲ）complex，CMPIC)的合成工藝，為新型口服鐵補(bǔ)充劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)；同時(shí)，通過(guò)抗氧化研究為尋求天然的抗氧化劑提供新的方向；另外，因羧甲基茯苓多糖的抗腫瘤活性，CMPIC 也可以為后續(xù)的抗腫瘤應(yīng)用提供探究材料。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

羧甲基茯苓多糖（99%）：泰安市嘉葉生物科技有限公司；ABTS+自由基：上海源葉生物科技有限公司；六水合氯化鐵、抗壞血酸、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、鄰菲啰啉、氯化亞鐵等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

鐵（II）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：精密稱(chēng)取（NH4）Fe（SO4）·26H2O 固體0.702 5 g，溶解于蒸餾水中并滴加適量鹽酸，以蒸餾水定容到1 L 的容量瓶中，低溫保存；鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)液（10 μg/mL，現(xiàn)配）：用移液管準(zhǔn)確移取10.0 mL 鐵（II） 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液蒸餾水定容到100 mL。CMPIC 樣品溶液的配制：分別配制1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL 的水溶液備用。

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Lambda25）：美國(guó)PerkenElmer 公司；數(shù)顯恒溫水浴攪拌鍋（SHJ-6）：金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；低速大容量離心機(jī)（TDL-5）：上海安亭科學(xué)儀器廠；pH 計(jì)（STARTER 2100）：上海奧豪斯儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020）：上海新苗醫(yī)療器材制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CMPIC 的制備

參照文獻(xiàn)[25-26]，取0.2 g 羧甲基茯苓多糖和0.2 g檸檬酸三鈉置于圓底燒瓶中，加入50 mL 蒸餾水溶解，緩慢滴加20%氫氧化鈉溶液和2.0 mol/L 三氯化鐵溶液并不斷振搖，直到溶液中出現(xiàn)少量紅棕色沉淀且沉淀不再溶解，停止滴加，調(diào)pH值至8.0，70 ℃水浴反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，5 000 r/min 離心5 min 去除沉淀，收集上層液體，分子量3 500 Da 截留透析袋常溫流水透析24 h，然后用超純水透析清洗12 h。在透析完的溶液中加入3 倍體積95%乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，再分別用無(wú)水乙醇、乙醚和丙酮洗滌沉淀，CMPIC 待用。

1.2.2 CMPIC 中鐵含量測(cè)定及鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用鄰菲啰啉顯色法[25，27]，取1.2.1 中適量CMPIC溶解并定容到50 mL，取出1 mL 稀釋至25 mL 作為樣品溶液。將1 mL 多糖鐵樣品溶液加入50 mL 容量瓶，分別加入5 mL 0.1%鄰菲啰啉溶液和2.5 mL 10%抗壞血酸溶液并定容，置于燒瓶中于37 ℃水浴中反應(yīng)3 h，最后在510 nm 測(cè)吸光度。然后帶入鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)公式中計(jì)算鐵含量。分別移取1.1 中鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6、7 mL 到25 mL 容量瓶中，配制成濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 μg/mL 鐵（Ⅱ）的溶液，分別加入10%的抗壞血酸溶液1.75 mL 和0.1%的鄰菲啰啉溶液2.5 mL，定容后轉(zhuǎn)移至燒瓶于37 ℃水浴反應(yīng)10 min，在510 nm 測(cè)吸光度，繪制鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 CMPIC 合成單因素試驗(yàn)

參考何瑞雪，王峰等[28-29]多糖鐵合成的單因素設(shè)計(jì)，在1.2.1 中制備CMPIC 方法下，設(shè)計(jì)反應(yīng)溶液的pH值（X1：6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），反應(yīng)溫度（X2：50、60、70、80、90 ℃）和檸檬酸三鈉（trisodium citrate dihydrate，TCD）與羧甲基茯苓多糖（carboxymethyl pachymaran，CMP）質(zhì)量的比值（X3：0.25、0.50、0.75、1.00、1.25）3 個(gè)單因素試驗(yàn)。力求分別找到最佳pH值、反應(yīng)溫度以及TCD 與CMP 質(zhì)量的比值。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1.2.3 單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化CMPIC 的合成工藝，選取pH（X1）、溫度（X2）、TCD 與CMP 的質(zhì)量的比值（X3）3 個(gè)要素進(jìn)行響應(yīng)面考察，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 CMPIC 的結(jié)構(gòu)表征

各制備2.0 mg/mL 的CMP 和CMPIC 水溶液，在200 nm～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描。

采用傅立葉變換紅外光譜儀，分別取適量CMP 干粉末和CMPIC 干粉末與適量KBr 混合壓片，在4 000 cm-1～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，測(cè)定CMP 和CMPIC紅外光譜圖。

1.2.6 FRAP 的測(cè)定

參考Que 等[30]描述的測(cè)定金屬螯合能力抗氧化活性方法。配制5mmol/LFeCl（2現(xiàn)配現(xiàn)用）：稱(chēng)取39.762mg FeCl2固體以蒸餾水溶解后定容到100 mL。配制5 mmol/L 鄰菲啰啉：稱(chēng)取123 mg 鄰菲啰啉固體用蒸餾水充分?jǐn)嚢璐芙夂蠖ㄈ莸?0 mL。分別將0.04 mL FeCl2溶液與0.08 mL 鄰菲啰啉溶液及1.08 mL 蒸餾水與0.4 mL 不同濃度的CMPIC 樣品溶液混合，于562 nm處測(cè)量吸光度A1，將樣品改為蒸餾水其他方法同A1測(cè)得A0，將蒸餾水代替氯化亞鐵溶液其他方法同A1測(cè)得A2。

清除率/%=[1-（A1-A2)/A0]×100

式中：A0為對(duì)照組吸光度（蒸餾水代替樣品）；A1為樣品吸光度；A2為樣品的本底吸光度（蒸餾水代替FeCl2溶液）。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果帶入計(jì)算清除率后取平均值。

1.2.7 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參考Re 等[31]的方法。配制7 mmol/L ABTS+自由基：稱(chēng)取384 mg ABTS+自由基固體蒸餾水溶解后定容到100 mL。配制15 mmol/L 過(guò)硫酸鉀：稱(chēng)取200.5 mg過(guò)硫酸鉀固體蒸餾水溶解后定容到50 mL。將7 mmol/L 1.6 mL ABTS+自由基溶液加入到0.4 mL 1.1 中不同濃度的CMPIC 樣品溶液中，在室溫（25 ℃）下反應(yīng)10 min后，在734 nm 處測(cè)量吸光度A1，將樣品改為蒸餾水其他方法同A1測(cè)得A0，將蒸餾水代替氯化亞鐵溶液其他方法同A1測(cè)得A2。清除率計(jì)算同1.2.6。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果帶入計(jì)算清除率后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照1.2.2 設(shè)計(jì)測(cè)定結(jié)果，以鐵離子濃度（X，μg/mL）對(duì)吸光度（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.196 6X-0.012 1（R2=0.999 8）。

2.2 單因素試驗(yàn)

取0.2 g CMP 溶于水中，按照1.2.3 中單因素設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值、溫度及TCD 與CMP 質(zhì)量比值對(duì)CMPIC 合成的影響Fig.1 Effect of pH,reaction temperature and the ratio of TCD to CMP on the synthesis of CMPIC

因CMPIC 溶液的吸光度與其鐵含量呈線性關(guān)系，故直接以吸光度值代表鐵含量。由圖1（A）可知，pH值對(duì)合成影響較大，隨著pH值增加，吸光度即含鐵量先升高后降低，在pH 8.0 時(shí)最大，在pH 10.0 時(shí)最低，可能是反應(yīng)體系堿性增加，導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)被破壞從而阻礙多糖鐵的合成，故最佳pH值選擇8.0；由圖1（B）可知，隨溫度升高，鐵含量先上升后下降，在70 ℃時(shí)達(dá)最大值，后降低可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，部分多糖喪失了活性導(dǎo)致合成多糖鐵效率降低，所以最佳溫度選為70 ℃；由圖（C）可知，鐵含量先上升后下降，在TCD 與CMP 質(zhì)量之比值為0.75 時(shí)含鐵量最大，所以最佳質(zhì)量比選0.75。其中，pH值對(duì)CMPIC合成的影響最大，反應(yīng)溫度次之，TCD 與CMP 質(zhì)量之比值影響相對(duì)最小。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 Box-behnken 設(shè)計(jì)因素水平及編碼值Table 1 Design factor level and code value

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 CMPIC 合成工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

參照1.2.4 設(shè)計(jì)，得到響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and the results of Box-Benhnken experiment

以羧甲基茯苓多糖鐵中鐵吸光度為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件，將表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=-4.316 4+0.879 15X1+0.034 714X2+0.151 25X3-0.000 647 5X1X2+0.046 9X1X3-0.000 1X2X3-0.057 8X12-0.000 200 75X22-0.385 2X32，并對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for items of regression equation

根據(jù)表3可知，除了X2X3即溫度和TCD 與CMP質(zhì)量的比值的交互作用不顯著，X1X2即pH值和溫度的交互作用顯著外，其余幾項(xiàng)均是極顯著。試驗(yàn)所建立的模型（P＜0.001）極顯著，失擬項(xiàng)（P=0.447 7＞0.05）不顯著，這些數(shù)據(jù)表明該試驗(yàn)所建立的響應(yīng)面模型用于優(yōu)化制備工藝是可行的。信噪比=48.720 比較高，說(shuō)明該模型可預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，而模型校正判定系數(shù)R2Adj=0.995 3，說(shuō)明該模型能夠證明預(yù)測(cè)99.53%的響應(yīng)值。判定系數(shù)R2=0.998 0，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以應(yīng)用該模型分析和預(yù)測(cè)工藝，R2Pred=0.983 5 與R2=0.998 0的值相差不大說(shuō)明該模型無(wú)需做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.2 CMPIC 合成工藝響應(yīng)面圖分析與對(duì)比

根據(jù)2.4.1 所得回歸方程，考察擬合響應(yīng)面的形狀，繪制響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

圖2 CMPIC 溶液的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of CMPIC

響應(yīng)面中各因素之間（A：pH-溫度；B：pH-TCD 與CMP 質(zhì)量比值；C：溫度-TCD 與CMP 質(zhì)量比值）的相互作用以及影響可以通過(guò)圖2 中響應(yīng)面圖中的曲線趨勢(shì)的陡峭程度以及等高線圖中等高線密集程度直觀地反應(yīng)出來(lái)。由圖2（A）可知，反應(yīng)pH值的效應(yīng)面相對(duì)更陡峭，等高線相對(duì)更密集，而反應(yīng)溫度的效應(yīng)面相對(duì)更平滑，等高線相對(duì)更稀疏，所以反應(yīng)pH值對(duì)合成CMPIC 的影響更為顯著些，反應(yīng)溫度對(duì)合成CMPIC的影響次之；同理，由圖2（B）可知，反應(yīng)pH值的效應(yīng)面相對(duì)更陡峭，等高線相對(duì)更密集，而反應(yīng)的TCD 與CMP 質(zhì)量比值效應(yīng)面相對(duì)更平滑，等高線相對(duì)更稀疏，所以反應(yīng)pH值對(duì)合成CMPIC 的影響更為顯著些，TCD 與CMP 質(zhì)量比值對(duì)合成CMPIC 的影響次之；由圖2（C）可知，反應(yīng)溫度的效應(yīng)面相對(duì)更陡峭，等高線相對(duì)更密集，而反應(yīng)的TCD 與CMP 質(zhì)量比值的效應(yīng)面相對(duì)更平滑，等高線相對(duì)更稀疏，所以反應(yīng)溫度對(duì)合成CMPIC 的影響更為顯著些，反應(yīng)TCD 與CMP質(zhì)量比值對(duì)合成CMPIC 的影響次之。上述結(jié)論與2.2中單因素顯著性分析結(jié)論完全吻合。由圖2（A～C）可以看出，響應(yīng)面和等高線存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)也就是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)[32]。通過(guò)觀察等高線圖中中心橢圓的情況可以了解兩兩交互作用的影響強(qiáng)弱：中心橢圓越接近圓形，兩兩交互作用相對(duì)越弱，越偏離圓形，交互作用越強(qiáng)。根據(jù)結(jié)論由圖2（A～C）等高線圖判斷可知：溫度和TCD 與CMP 質(zhì)量比值即X2X3的交互作用最弱，pH值和TCD 與CMP 質(zhì)量比值即X1X3的交互作用最強(qiáng)，pH值和溫度即X1X2的交互作用適中，這一結(jié)論也與表3 方差分析結(jié)果完全吻合。

2.4.3 最佳提取工藝驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面軟件優(yōu)化所得到的最佳合成工藝條件為：反應(yīng)pH值為8.3，反應(yīng)溫度為72.9 ℃，TCD 與CMP 質(zhì)量比為0.69，此時(shí)理想的吸光度值為0.255 0。為檢驗(yàn)該模型的可靠性，按照上述最佳方案進(jìn)行5 組平行試驗(yàn)。實(shí)際合成條件取反應(yīng)pH 8.3，反應(yīng)溫度73 ℃，TCD 與CMP 質(zhì)量比0.7，對(duì)5 組結(jié)果取平均值，平均吸光度值為0.245 0，實(shí)際值與理論值相近，相對(duì)誤差僅為4.29%?？梢?jiàn)此模型可靠，可以用來(lái)作為合成的模型，并用來(lái)優(yōu)化的合成工藝在此最優(yōu)條件下得到含鐵量為27.55%。

2.5 CMPIC 結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 紫外光譜分析

為了表征合成的CMPIC 的結(jié)構(gòu)，對(duì)CMP 和CMPIC 分別進(jìn)行了紫外掃描，其掃描圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 CMP 和CMPIC 紫外掃描光譜Fig.3 Ultraviolet scanning spectrum of CMP and CMPIC

由圖3 中CMP 與CMPIC 的紫外掃描光譜曲線對(duì)比可以看出，在同樣濃度下，與CMP 相比，CMPIC 在紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯增加，說(shuō)明CMP 與鐵反應(yīng)生成了復(fù)合物，無(wú)游離物質(zhì)存在。CMP 中的生色基團(tuán)有羧基、羰基和酯基，助色基團(tuán)是-OH，CMPIC 紫外吸收增強(qiáng)，表明CMP 中助色團(tuán)-OH 與鐵發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)使助色團(tuán)發(fā)生變化[29，33]。

2.5.2 紅外光譜分析

為進(jìn)一步表征合成的CMPIC 的結(jié)構(gòu)，對(duì)CMP 和CMPIC 分別進(jìn)行了紅外分析，其紅外圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 CMP 和CMPIC 紅外光譜Fig.4 IR spectroscopy of CMP and CMPIC

由圖對(duì)比可知，兩者具有相似的特征吸收峰，說(shuō)明與鐵螯合后多糖結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生變化。CMPIC 和CMP 中出現(xiàn)在3 402.22 cm-1及3 432.17 cm-1峰為-OH的伸縮振動(dòng)峰，相對(duì)而言，CMPIC 中-OH 的伸縮振動(dòng)峰的峰型變窄，說(shuō)明螯合反應(yīng)導(dǎo)致-OH 振動(dòng)變?nèi)酢ＥcCMP 相比（其C = O 伸縮振動(dòng)峰為1 636.95 cm-1），CMPIC 的C=O 伸縮振動(dòng)峰（1 602.04 cm-1）向低波數(shù)偏移，說(shuō)明羧基也參與了螯合[18]。

2.6 CMPIC 的抗氧化分析

2.6.1 FRAP 的測(cè)定

金屬離子（如鐵和銅）在機(jī)體的氧化中起催化作用。金屬離子的螯合可以大大降低金屬離子的催化作用，避免機(jī)體氧化產(chǎn)生自由基。因此，測(cè)定樣品的金屬螯合能力大小是測(cè)定其抗氧化性能的常用評(píng)價(jià)方法之一。各濃度CMPIC 金屬螯合能力如圖5所示（帶標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

圖5 CMPIC 對(duì)Fe2+的清除能力Fig.5 Scavenging effects of CMPIC on Fe2+ chelating capacity

隨著濃度增加，CMPIC 對(duì)Fe2+清除能力逐步增加，當(dāng)濃度為10 mg/mL 時(shí)最大清除率達(dá)到45.53%，但隨著濃度繼續(xù)增加，清除率反而降低，可能是由于CMPIC樣品濃度過(guò)高，黏度增加抑制了其與Fe2+的鰲合。

2.6.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

ABTS+自由基測(cè)定常用于測(cè)量潛在抗氧化劑的總抗氧化能力，也可用作反映測(cè)試樣品抗氧化活性的指標(biāo)[32]。濃度依賴性自由基清除活性如圖6所示（帶標(biāo)準(zhǔn)偏差）。與清除金屬離子相比，在相同梯度濃度CMPIC下，ABTS+自由基清除能力隨著樣品濃度的增加而增加，因CMPIC 溶解性的問(wèn)題后續(xù)沒(méi)法繼續(xù)增加CMPIC濃度，故在此濃度范圍下，對(duì)ABTS+自由基具有一定的清除作用，可作為潛在的抗氧化劑進(jìn)行后期探索。

圖6 CMPIC 對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging effects of CMPIC on ABTS+radical cation

3 結(jié)論

選用羧甲基茯苓多糖為材料，通過(guò)單因素考察，得出合成羧甲基茯苓多糖鐵的最佳單因素條件為：pH8.0，溫度80 ℃，檸檬酸三鈉：羧甲基茯苓多糖質(zhì)量比為0.75。進(jìn)一步運(yùn)用響應(yīng)面軟件Design-Expert 優(yōu)化合成工藝，得出羧甲基茯苓多糖鐵合成最佳的條件為：pH值為8.3，溫度為72.9 ℃，檸檬酸三鈉：羧甲基茯苓多糖質(zhì)量比為0.69。經(jīng)過(guò)對(duì)羧甲基茯苓多糖鐵的紫外及紅外結(jié)構(gòu)表征，表明多糖鐵合成成功。同時(shí)對(duì)羧甲基茯苓多糖鐵進(jìn)行了抗氧化研究，結(jié)果表明羧甲基茯苓多糖鐵對(duì)金屬離子以及ABTS+自由基具有一定的清除能力。