范媛媛 丁俊胄,2 熊善柏 許綽微 趙思明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，武漢 430070) (美國(guó)伊利諾伊大學(xué)香檳分校食品科學(xué)與人類營(yíng)養(yǎng)學(xué)系2，厄巴納 61801)

γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid, GABA)作為人體內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在降低心血管疾病[1-2]、高血壓[3]、緩解焦慮[4]，改善神經(jīng)感知功能、延緩記憶力衰退等方面具有功效[5-7]。

通過(guò)谷物種子萌發(fā)及對(duì)新鮮植物幼芽、葉片進(jìn)行缺氧處理可生產(chǎn)出高GABA濃度的天然食品。糙米在發(fā)芽3 d后GABA含量得到顯著提升，在發(fā)芽后期進(jìn)行缺氧脅迫處理則使含量進(jìn)一步提高[8-10]。除此以外，化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法均可制備高純度的GABA。采用微生物制備GABA反應(yīng)條件易于控制，目前已有用大腸桿菌[11-15]、乳酸菌[13-14]、酵母[15]以及霉菌[16-17]等微生物發(fā)酵制備GABA的報(bào)道。利用微生物體內(nèi)代謝的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD; EC 4.1.1.15)為催化酶，以食品級(jí)谷氨酸或谷氨酸鈉鹽作為主要底物經(jīng)谷氨酸脫羧反應(yīng)制備GABA。

糙米中內(nèi)源性淀粉酶和蛋白酶在發(fā)芽過(guò)程被激活，將淀粉和蛋白質(zhì)等大分子水解[18]，水解產(chǎn)生的小分子糖等營(yíng)養(yǎng)組分可以被乳酸菌和酵母菌利用[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌與酵母菌之間存在代謝產(chǎn)物共生與互補(bǔ)效應(yīng)，酵母菌代謝產(chǎn)物可以刺激乳酸菌活動(dòng)，為乳酸菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌水解產(chǎn)物則為酵母菌提供豐富的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[20-22]。

本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)芽糙米為發(fā)酵底物，以短乳桿菌、卡斯特酒香酵母為發(fā)酵菌種，研究初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間，及菌株配比對(duì)GABA發(fā)酵產(chǎn)量的影響，優(yōu)化了復(fù)合發(fā)酵法強(qiáng)化GABA的工藝條件，并初步探究乳酸菌和酵母菌的共生現(xiàn)象，為利用糙米發(fā)芽與發(fā)酵制備高濃度GABA食品提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)L2，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供。

卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001，本實(shí)驗(yàn)室從米漿的發(fā)酵液分離得到，其保藏號(hào)為CCTCC NO: M207150。

稻谷原料為“黃花占”水稻品種：湖北黃岡東坡糧油集團(tuán)有限公司。

L-谷氨酸、L-亮氨酸葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、檸檬酸二胺、乙酸鈉、殼聚糖。

1.2 儀器與設(shè)備

植物氣候培養(yǎng)箱；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)；臺(tái)式離心機(jī)；722型分光光度計(jì)；JMS-50膠體磨。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

將活化菌種接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48 h，得到菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)液，按所需體積比加入發(fā)酵培養(yǎng)基，得到發(fā)酵液。分別取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)高速離心機(jī)離心，收集清液，向清液中加入0.25 g/L的殼聚糖，攪拌后得絮凝液，將所得的絮凝液過(guò)濾，得過(guò)濾液，即發(fā)酵液粗液。

發(fā)酵液粗液中加入1 %(質(zhì)量比)活性炭，混合均勻后于70 ℃下攪拌30 min，過(guò)濾后得到未純化的GABA溶液,將未純化的GABA溶液于25 kPa壓力下濃縮60 min，使?jié)饪s液體積約為濃縮前的1/3，得濃縮的GABA溶液,將濃縮的GABA溶液于90 ℃下滅菌40 min，得高濃度液態(tài)GABA。

1.3.2 發(fā)芽糙米的制備

選擇實(shí)驗(yàn)用小型壟谷機(jī)去掉谷殼制備糙米，參考丁俊胄等[8]報(bào)道的發(fā)芽條件并采用課題組自行設(shè)計(jì)改裝的水霧供濕通氣培養(yǎng)裝置[23]制備發(fā)芽糙米。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基

菌株的活化培養(yǎng)基(即：改良MRS培養(yǎng)基，以g/L計(jì))：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，瓊脂15 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉2 g/L，檸檬酸二胺2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，用于菌種的活化。

發(fā)酵種子培養(yǎng)基(即GYP種子培養(yǎng)基，以g/L計(jì))：胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，丁二酸鈉5 g/L，用于菌種發(fā)酵種子的制備。

發(fā)酵培養(yǎng)基(以g/L計(jì))：將發(fā)芽糙米加水，使谷物與水的體積比為1∶10，用膠體磨磨漿，在漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，用于發(fā)酵合成GABA。

1.3.4 酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基

菌株的活化培養(yǎng)基(即YEPD培養(yǎng)基，以g/L計(jì))：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，用于菌株的活化。

發(fā)酵種子培養(yǎng)基(以g/L計(jì))：葡萄糖30 g/L，蛋白胨30 g/L，硫酸銨3 g/L，KH2PO41 g/L，用于菌株發(fā)酵種子的制備。

發(fā)酵培養(yǎng)基(以g/L計(jì))：將發(fā)芽糙米加水，使谷物與水的體積比為1∶10，用膠體磨磨漿，在漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，用于發(fā)酵合成GABA。

1.3.5 GABA含量的測(cè)定

根據(jù)Berthelot顯色反應(yīng)原理，參考姚森等[24]報(bào)道的比色法測(cè)定GABA含量。

1.3.6 GAD活性的測(cè)定

按照1.3.1中描述的菌種發(fā)酵的工藝流程，分別取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，將發(fā)酵液在4 000 r/min下離心10 min，過(guò)濾后的上清液即為粗酶液。參考丁俊胄等[8]報(bào)道的方法測(cè)定GAD活性。

取0.3 mL粗酶液與0.2 mL底物反應(yīng)液(含50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 5.7)、0.2 mmol/L 磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)，100 mmol/LL-谷氨酸)置于10 mL比色管中，于30 ℃水浴鍋里保溫2 h后迅速冰浴終止反應(yīng)，同時(shí)取0.3 mL蒸餾水與0.2 mL底物反應(yīng)液做空白對(duì)照，采用1.3.5中比色法測(cè)定GABA的含量。

酶活計(jì)算方法為：(酶反應(yīng)生成的GABA含量-空白中GABA含量)/反應(yīng)時(shí)間。

以每分鐘生成1 μmol GABA所需要的酶量為一個(gè)谷氨酸脫羧酶活力單位(U)。

1.3.7 適宜培養(yǎng)基初始pH的確定

設(shè)定培養(yǎng)基初始pH，按體積比4%的接種量接入種子液，乳酸菌在30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)60 h(酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)96 h)，測(cè)定不同pH下發(fā)酵液中GABA的含量。

1.3.8 適宜接種量的確定

乳酸菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 4.5(酵母菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 5.5)，分別按不同體積比接入種子液，于30 ℃溫度下發(fā)酵培養(yǎng)60 h(酵母菌發(fā)芽培養(yǎng)96 h)，測(cè)定不同接種量下發(fā)酵液中GABA的含量。

1.3.9 適宜發(fā)酵溫度的確定

乳酸菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 4.5(酵母菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 5.5)，按體積比4 %的接種量接入種子液，分別在不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵培養(yǎng)60 h(酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)96 h)，測(cè)定不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵液中GABA的含量。

1.3.10 適宜發(fā)酵時(shí)間的確定

乳酸菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 4.5(酵母菌設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 5.5)，按體積比4%接種量接入種子液，于30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵液中GABA的含量。

1.3.11 發(fā)酵法條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素，每個(gè)因素確定3個(gè)水平，不考慮交互作用，選用L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表2。

1.3.12 復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵的影響

將發(fā)芽糙米加水(發(fā)芽糙米∶水=1∶10，V/V)磨漿，向漿液中加入L-谷氨酸鈉60 g/L、葡萄糖50 g/L，按體積比為4%的接種量向漿液中接種復(fù)合菌種(乳酸菌和酵母菌)，乳酸菌∶酵母菌(數(shù)量比)=1∶1時(shí)，攪拌混勻后于30 ℃下密封發(fā)酵90 h，得含GABA的發(fā)酵液。在用復(fù)合菌種發(fā)酵富集GABA過(guò)程中設(shè)計(jì)了不同的菌種和配比，以探索復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵液GABA含量的影響。按待發(fā)酵漿液體積為1 L，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 菌種配方設(shè)計(jì)

1.3.13 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Software Institute, Cary, NC,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異檢測(cè)限設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程GABA的累計(jì)

不同培養(yǎng)條件下，發(fā)酵過(guò)程GABA的積累曲線見(jiàn)圖1。由圖1a可知，乳酸菌在培養(yǎng)基初始pH為4.5時(shí)，發(fā)酵液中GABA的含量達(dá)到最大值。而酵母菌在培養(yǎng)基初始pH 5.5時(shí)，菌種發(fā)酵制備的發(fā)酵液中GABA的含量達(dá)到最大值。由于GAD蛋白分子上含有許多酸性或堿性的側(cè)鏈基團(tuán)，較高或較低的pH都可能影響GAD蛋白分子的構(gòu)象，使側(cè)鏈基團(tuán)電解，降低GAD的活性，從而對(duì)GAD與L-Glu結(jié)合的能力產(chǎn)生影響[25]，使GABA累計(jì)量降低。接種量對(duì)乳酸菌和酵母菌產(chǎn)GABA的影響結(jié)果見(jiàn)圖1b。隨著接種量的增加，微生物代謝產(chǎn)生的GAD活性增強(qiáng)，GABA累積量逐漸增加。當(dāng)乳酸菌和酵母菌接種量均大于4%時(shí)，隨著底物的減少，接種量增大并沒(méi)有顯著增加發(fā)酵液中GABA的含量。發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌和酵母菌產(chǎn)GABA的影響結(jié)果見(jiàn)圖1c。當(dāng)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，發(fā)酵液中GABA的含量最高。

發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌和酵母菌產(chǎn)GABA的影響結(jié)果見(jiàn)圖1d。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA累積量逐漸增加。乳酸菌發(fā)酵法制備 GABA的最適發(fā)酵時(shí)間為60 h，酵母菌最適發(fā)酵時(shí)間為96 h。

發(fā)酵制備GABA的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2、表3。影響乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量的因素主次為B(培養(yǎng)時(shí)間)>C(培養(yǎng)溫度)>A(接種量)，接種量的3個(gè)水平對(duì)菌種發(fā)酵制備的發(fā)酵液中GABA的含量有影響(0.05

影響酵母菌發(fā)酵液中GABA的含量的因素主次為C(培養(yǎng)溫度)>B(培養(yǎng)時(shí)間)>A(接種量)，接種量的3個(gè)水平對(duì)發(fā)酵液中GABA的含量有影響(0.05

圖1 培養(yǎng)條件對(duì)GABA積累量的影響

由表2和表3可知，乳酸菌發(fā)酵制備GABA的最佳工藝組合為A2BR2C1，即乳酸菌的接種量為4%，于30 ℃溫度下發(fā)酵60 h。而酵母菌發(fā)酵制備GABA的最佳工藝組合為A2BJ2C1，即接種量為4%，于30 ℃溫度下發(fā)酵培養(yǎng)96 h。由于乳酸菌和酵母菌的共生作用，本實(shí)驗(yàn)所制備的發(fā)酵液中，GABA的含量高于現(xiàn)有報(bào)道中采用酵母菌發(fā)酵制備的GABA產(chǎn)品濃度(3～5 g/L)[26]。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：BR代表乳酸菌，BJ代表酵母菌。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表(F/P)

2.2 發(fā)酵液乳酸菌和酵母菌的共生效應(yīng)

乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌種的配比對(duì)菌種發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響如圖2所示。隨著酵母菌的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢(shì)。在復(fù)合菌種各配比中又以乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌種的體積比為2∶1時(shí)(乳酸菌液27 mL，酵母菌液13 mL)，發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化富集所得的GABA的含量最高，為33.25 g/L，而使用單一菌種乳酸菌或酵母菌發(fā)酵制備的發(fā)酵液中GABA的含量分別為27.79 g/L和22.04 g/L。由此可見(jiàn)，復(fù)合菌種發(fā)酵法比單獨(dú)使用乳酸菌或酵母菌發(fā)酵制備GABA分別提高了19.6%和50.8%。

由圖3可知，乳酸菌發(fā)酵48 h時(shí)，GAD活性達(dá)到了峰值，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，GAD活性開(kāi)始下降(圖3a)。在發(fā)酵0～60 h范圍內(nèi)，GABA的生成量大于消耗量，因此GABA含量不斷地積累，直到60 h達(dá)到最高值。隨著底物的不足，GABA生成量和消耗量達(dá)到平衡，GABA含量趨于平衡(圖3b)。

酵母菌發(fā)酵72 h時(shí)，GAD活性達(dá)到最大值，此后繼續(xù)發(fā)酵，GAD的活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低。在發(fā)酵時(shí)間為24～96 h范圍內(nèi)，發(fā)酵液中GABA的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，在發(fā)酵時(shí)間為96～120 h范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中GABA的含量并沒(méi)有顯著性變化。

乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵72 h時(shí)，GAD活性達(dá)到最大值。在發(fā)酵72 h后，GAD活性顯著降低，在發(fā)酵時(shí)間為24～96 h范圍內(nèi)，發(fā)酵液中GABA含量顯著性增加，但在96～120 h間并沒(méi)有顯著變化(圖3b)。乳酸菌和酵母菌之間存在的代謝產(chǎn)物互補(bǔ)效應(yīng)[21,27]，使得發(fā)酵液中產(chǎn)GABA含量比單獨(dú)使用乳酸菌或酵母菌高。

圖2 菌種配比對(duì)菌體產(chǎn)GABA的影響

注：乳酸菌培養(yǎng)條件：pH 4.5，接種量4 %，溫度30 ℃；酵母菌培養(yǎng)條件：pH 5.5，接種量4%，溫度30 ℃；復(fù)合菌種培養(yǎng)條件：復(fù)合菌種比例：2∶1，接種量4%,溫度30 ℃。圖3 發(fā)酵過(guò)程中GABA(a)的累計(jì)及GAD(b)酶活性的動(dòng)態(tài)變化

3 結(jié)論

發(fā)芽糙米經(jīng)短乳桿菌L2和酵母菌(ZSM001)復(fù)合發(fā)酵，比單用短乳桿菌和卡斯特酒香酵母發(fā)酵分別提高19.6%和50.8%，本研究表明，將乳酸菌和酵母菌復(fù)配具有良好的協(xié)同共生效應(yīng)，適宜的發(fā)酵工藝為：當(dāng)短乳桿菌和卡斯特酒香酵母復(fù)合菌種的體積比2∶1，接種量4%，于30 ℃溫度下培養(yǎng)90 h，發(fā)酵轉(zhuǎn)化所得GABA的含量最高達(dá)33.25 g/L。乳酸菌和酵母菌以適當(dāng)比例在發(fā)酵液中共生時(shí)，代謝過(guò)程呈現(xiàn)一定互補(bǔ)，微生物體內(nèi)谷氨酸脫羧酶的活性增強(qiáng)，促進(jìn)了GABA積累。